2.2 – Mikroskopi, instrumenterne

Det simple mikroskop, som van Leeuwenhoek brugte i det 17’ende århundrede, havde kun en linse og var lig et forstørrelsesglas. Van Leeuwenhoek var dog den bedste linsesliber i verden på sin tid. Hans linser blev slebet med så stor præcision, at de kunne forstørre en mikroorganisme 300 gange. Hans simple mikroskoper gjorde det muligt for ham, som den første i verden, at se bakterier.

Andre i hans samtid, som for eksempel Robert Hooke, byggede sammensatte mikroskoper, der havde flere linser. Faktisk er en hollandsk brillemager, krediteret for at være den første der byggede et sammensat mikroskop omkring 1600. Disse tidlige sammensatte mikroskoper, var dog af dårlig kvalitet og kunne ikke bruges til at se bakterier med. Det var ikke før 1830 at et betydeligt bedre mikroskop blev udviklet af Joseph Jackson Lister (Joseph Listers far).

Forskellige forbedringer af Listers mikroskop, har resulteret i udviklingen af det moderne mikroskop, der anvendes i mikrobiologi i dag. Mikroskopiske studier af levende individer, har afsløres dramatiske interaktioner mellem mikroorganismer.

2.2.1 Lysmikroskopi

Lysmikroskopi henviser til brugen af et hvert mikroskop der bruger synligt lys til observation af prøver. Her beskrives flere forskellige typer af lysmikroskopi.

Sammensat lysmikroskop

Et moderne sammensat lysmikroskop (LM) har en serie af linser og bruger synligt lys som sin belysningskilde. Med et sammensat lysmikroskop, kan man undersøge meget små emner så vel som nogle af deres fine detaljer. En serie af præcist slebne linser, danner et klart fokuseret billede, der er mange gange større en emnet selv. Denne forstørrelse opnås når lyset fra en illuminator, lyskilden, passerer gennem en kondensor, som har linser der dirigerer lysstrålen gennem emnet. Herfra, passerer lysstrålerne ind i objektivlinserne, som er linserne tættest på emnet. Billedet af emnet, bliver yderligere forstørret af okularet.

Man kan beregne den samlede forstørrelse af et emne ved at gange objektivets forstørrelse med okularets forstørrelse. De fleste mikroskoper der bruget i mikrobiologi har flere objektivlinser, for eksempel 10x (lav forstørrelse), 40x (høj forstørrelse) og 100x (olieimmersion). De fleste okularlinser forstørrer emnet med en faktor 10. Ved at gange forstørrelsen for objektivlinsen med okularets forstørrelse, får man den samlede forstørrelse. Dermed får man en samlet forstørrelse på 100x for den lave forstørrelse, 400x for den høje og 1000x for olieimmersion. Nogle mikroskoper kan opnå en samlet forstørrelse på 2000x med immersionsolielinsen.

Figur 2.1.1 – Mikroskopets opbygning

Opløsning (også kaldet opløsningsevne) er linsernes evne til at skelne fine detaljer og strukturer. Specifikt refererer det til linsen evne til at skelne to punkter, der er en i en specifik afstand fra hinanden. For eksempel, hvis et mikroskop har opløsningsevnen 0,4 nm, betyder det at det kan skelne to punkter fra hinanden, hvis de er 0,4 nm eller mere fra hinanden. Et generelt princip i mikroskopi er, at jo kortere bølgelængde lyset der bruges har, jo højere er opløsningsevnen. Det hvide lys der anvendes i det sammensatte lysmikroskop, har en relativt lang bølgelængde og kan ikke opløse strukturer der er mindre end omkring 0,2 µm. Dette og andre hensyn, begrænser den maksimale forstørrelse der kan opnås med sammensatte lysmikroskoper, til omkring 2000x. Til sammenligning, havde van Leeuwenhoeks mikroskop en opløsningsevne på 1 µm.

For at opnå et klart, fint detaljeret billede under et sammensat lysmikroskop, skal emnet være i stor kontrast til mediet (den substans det er opløst i). For at opnå en sådan kontrast, må man ændre det refraktive indeks mellem emnet og dets medium. Det refraktive indeks er et mål for et medies lysbøjende evne. Man ændrer det refraktive indeks for emnet, ved at farve det. En procedure der vil blive beskrevet senere. Lysstrålerne bevæget sig i en lige linje gennem et enkelt medium. Efter et emne er blevet farvet, har emnet og mediet forskellige refraktive indekser. Når lysstråler passerer gennem de to materialer (emnet og dets medium), ændrer lysstrålerne retning (refrakterer) fra en lige linje ved at bøje eller ændre vinkel på grænsen mellem de materialerne. Dette øger billedets kontrast mellem emnet og mediet. Som lysstrålerne rejser bort fra emnet, spredes de og kommer ind i objektivlinsen og billedet bliver hermed forstørret.

Figur 2.1.2 – Lysets vej gennem mikroskopet

For at opnå høj forstørrelse (1000x) med god opløsning, skal objektivlinsen være lille. Selvom vi ønsker at lys der rejser gennem emnet og mediet skal refraktere forskelligt, ønsker vi ikke at miste noget af lyset efter det er passeret gennem det farvede emne. For at bibeholde lysets retning ved den højeste forstørrelse, bliver immersionsolie placeret mellem objektglasset/dækglasset og olieimmersionsobjektivet. Se figur 2.1.3. Immersionsolie har det samme refraktive indeks som glas, så olien bliver en del af glasoptikken i mikroskopet. Hvis ikke immersionsolie anvendes, bliver lysstrålerne refrakteret når de går fra emnet/dækglasset over i luften mellem emnet/dækglasset og objektivet og derfor må diameteren på objektlinsen øges for at fange de fleste af lysstrålerne. Olien har den samme effekt, som at øge objektivets diameter og derfor forbedrer den opløsningsevnen for objektiverne. Hvis ikke olie bruges sammen med immersionsolieobjektiverne, får billederne en dårlig opløsning og bliver slørede.

Figur 2.1.3 – Refraktion i et sammensat lysmikroskop ved brug af en immersionsolielinse med og uden brug af immersionsolie
Figur 2.1.4 – Celle set gennem et brightfield mikroskop

Under normale driftsforhold, er synsfeltet på et sammensat lysmikroskop stærkt oplyst. Ved at fokusere lyset, frembringer kondensatoren et lyst feltbelysningsområde, kaldet for brightfield illumination – Se figur 2.1.4.

Det er ikke altid ønskværdigt at farve et emne, men en ufarvet celle har en lille kontrast til dens omgivelser og er derfor svær at se. Ufarvede celler er lettere at observere med de modificerede sammensatte mikroskoper, beskrevet i de næste afsnit.

Darkfield mikroskopi

Figur 2.1.5 – Celle set gennem et darkfield mikroskop

Et darkfield mikroskop bliver brugt til at undersøge levende mikroorganismer, der enten er usynlige i det normale lysmikroskop, ikke kan farves med standardmetoderne eller bliver så forvrængede af farvning, at deres karakteristika bliver tilsløret. Et darkfield mikroskop bruger en darkfield kondensor, der indeholder en uigennemsigtig plade. Pladen blokerer for det lys der ville komme direkte ind i objektivlinsen. Kun lys der bliver reflekteret bort fra emnet kommer ind i objektivet. Da der ikke er nogen direkte baggrundsbelysning, vil emnet virke lyst mod en mørk baggrund – og det der kaldes det mørke felt, eller darkfield. Se figur 2.1.5. Denne teknik anvendes ofte, til at studere levende mikroorganismer suspenderet i væske. En brug af darkfield mikroskopi er undersøgelsen af meget tynde spirocheter, som for eksempel Temponema pallidum, der forårsager syfilis.

Fase-kontrast mikroskopi

An anden måde at iagttage mikroorganismer er med et fase-kontrast mikroskop. Fase-kontrast mikroskopi er speciel brugbar, fordi de interne strukturer i en celle bliver mere skarpt defineret, hvilket tillader detaljeret undersøgelse af levende mikroorganismer. Det er heller ikke nødvendigt at fiksere (fastgøre mikroorganismerne til objektglasset) eller farve emnet – procedurer som kan forvrænge eller dræbe mikroorganismerne.

Figur 2.1.6 – Celle set gennem et fase-kontrast mikroskop

I fase-kontrast mikroskopet, kommer et sæt lysstråler direkte fra lyskilden. Det andet sæt lysstråler, kommer fra lys der er blevet reflekteret eller afbøjet (diffraktion) af en bestemt struktur i emnet (diffraktion er spredningen af lyset som det rammer et emnes kant. De afbøjede lysstråler bliver bøjet væk fra de parallelle lysstråler der passerer længere væk fra emnet). Når de tå sæt lysstråler – de direkte lysstråler og de afbøjede eller reflekterede lysstråler – bliver bragt sammen, frembringer de et billede i okularet, indeholdende områder der er relativt lyse (i fase), gennem nuance fra grå til sort (ude af fase). Se figur 2.1.6.

Differential interferens kontrast mikroskopi

Figur 2.1.7 – Celle set gennem et DIK mikroskop

Differential Interferens Kontrast (DIK) mikroskopi ligner fase-kontrast mikroskopi, da det også benytter forskelle i refraktionsindekset. Det differential interferens kontrast mikroskop, bruger dog to lysstråler i stedet for en. Hertil kommer prismer, der opdeler hver lysstråle og tilføjer derved kontrastfarver til emnet. Derfor er opløsningen af et DIK mikroskop højere, end den man opnår med et normalt fase-kontrast mikroskop. Derudover, er billederne farvestrålende og ser næsten tredimensionelle ud. Se figur 2.1.7.

Fluorescens mikroskopi

Figur 2.1.8 – Celle set gennem et fluorescens mikroskop

Fluorescens mikroskopi udnytter fluorescens, stoffers egenskab til at absorbere lys med korte bølgelængder (ultraviolet) og afgive lys med længere bølgelængder (synligt). Nogle organismer fluorescerer naturligt i ultraviolet lys; hvis emnet der skal undersøges, ikke selv har naturlig fluorescens, farves det med en af en gruppe fluorescerende farvestoffer, kaldet fluorokromer. Når mikroorganismer farvet med et fluorokrom undersøges i et fluorescens mikroskop med en ultraviolet eller nær-ultraviolet lyskilde, fremstår de som selvlysende, lyse objekter mod en mørk baggrund. Se figur 2.1.8.

Fluorokromer har særlige tiltrækninger for forskellige mikroorganismer. For eksempel fluorokromet auramine O, der lyser gult når det udsættes for ultraviolet lys, bliver kraftigt absorberet af Mycobacterium tuberculosis, bakterien der forårsager tuberkulose. Når farvestoffet påføres en prøve af materiale der er mistænkt for at indeholde denne bakterie, kan bakterien opdages ved tilstedeværelsen af lysegule organismer mod en mørk baggrund. Bacillus anthracis, som forårsager miltbrand, ses som æblegrøn når den farves med et andet fluorokrom, fluorescein isothiocyanat (FITC).

Den væsentligste anvendelse af fluoriescensmikroskopi, er en diagnostisk teknik, kaldet fluorescerende-antistof (FA) teknik, eller immunofluorescens. Antistoffer er naturlige forsvarsmolekyler, der produceres af mennesker og mange andre dyr, som reaktion på et fremmed stof, eller antigen. Fluorescerende antistoffer for et bestemt antigen opnås på denne måde: Et dyr injiceres med et bestemt antigen, for eksempel en bakterie, og dyret begynder herefter at danne antistoffer i mod dette antigen. Efter en tilstrækkelig tidsperiode, fjernes antigenerne fra serummet fra dyret. Herefter, som vist i figur 2.1.9, kombineres et fluorokrom kemisk, med antistoffet. Disse fluorescerende antistoffer tilføres herefter til et objektglas, indeholdende en ukendt bakterie. Hvis den ukendte bakterie er den samme, som den der blev sprøjtet ind i dyret, vil de fluorescerende antistoffer binde sig til overfladen på bakterien, så den fluorescerer.

Figur 2.1.9 – Princippet i Fluorescerende antistof teknikken også kendt som immunofluorescens

Denne teknik kan finde bakterier eller andre patogene mikroorganismer, selv inde i andre celler, i væv eller andre kliniske emner. Det er af afgørende betydning, at denne metode kan bruges til at identificere en mikroorganisme, på få minutter. Immunofluorescens er specielt brugbar i identifikation af syfilis og rabies.

Konfokal mikroskopi

Figur 2.1.10 – Celle set med konfokal mikroskopi

Konfokal mikroskopi er en teknik i lysmikroskopien, der bruges til at rekonstruere tredimensionelle billeder. Ligesom med fluorescensmikroskopi, farves emnerne med fluorokromer, så de vil udsende, eller reflektere, lys. Men i stedet for at belyse hele feltet, bliver et plan af en lille region af emnet, belyst med kortbølget lys (blåt), som sender det returnerede lyst igennem en lille åbning der er afstemt med den belyste region. Hvert plan, svarer til et billede af en fin skive, der er blevet fysisk afskåret fra emnet. Flere på hinanden følgende flader og regioner belyses, indtil hele emnet er blevet skannet. Fordi konfokal mikroskopi, anvender det der kaldes for et nålehulsapertur, eliminerer dette den sløring der ofte fremkommer med andre mikroskoper. Som et resultat af dette, kan man opnå usædvanligt skarpe todimensionelle billeder, med en forbedret opløsning på op til 40% bedre, end den andre mikroskoper kan præstere, se figur 2.1.10.

De fleste konfokale mikroskoper, bruges sammen med computere, til at konstruere tredimensionelle billeder. De skannede flader af emnet, der repræsenterer en stak af billeder, bliver konverteret til en digital form, hvor computere så kan bruge billederne til at rekonstruere et tredimensionelt billede. Det rekontruerede billede, kan vendes og drejes og dermed iagttages fra alle tænkelige vinkler. Denne metode har været anvendt til at lave tredimensionelle billeder af hele celler og cellekomponenter. I tillæg, kan konfokal mikroskopi, anvendes til at evaluere cellulær fysiologi, ved at iagttage distributionen og koncentrationen af stoffer som for eksempel ATP og calciumioner.

2.2.2 To foton mikroskopi

Figur 2.2.2.1 – Eksempel på to foton mikroskopi

Som med konfokal mikroskopi, bliver emnerne farvet med fluorokromer til to foton mikroskopi (TFM). To foton mikroskopi, bruger lys med lange bølgelængder (rødt), og derfor behøves to fotoner, i stedet for en, for at få fluorokromet til at udsende lys. Den længere bølgelængde, tillader billeder af levende celler i vævsprøver op til 1 mm (1.000 µm) dybe, se figur 2.2.2.1. Det konfokale mikroskop kan kun afbilde celler i detalje op til 100 µm dybe. Derudover, er den længere bølgelængde mindre tilbøjelig, til at danne singlet oxygen, der skader cellerne. An anden fordel ved to foton mikroskopi, at det kan følge cellers aktivitet i realtid. For eksempel, har man observeret celler fra immunsystemet, reagere på et antigen.

 

2.2.3 Skanning akustisk mikroskopi

Figur 2.2.3.1 – Eksempel på skanning akustisk mikroskopi

Skanning akustisk mikroskopi (SAM) består dybest set af, at fortolke virkningen af en lydbølge der sendes gennem et emne. En lydbølge med en specifik frekvens, sendes igennem emnet og en del af den reflekteres tilbage, hver gang den rammer en grænseflade inde i emnet. Opløsningsevnen er omkring 1 µm. SAM bruges til undersøgelse af levende celler, fastgjort til en anden overflade, som for eksempel kræftceller, arterieplader og bakteriefilm der forurener udstyr. Se figur 2.2.3.1

2.2.4 Elektronmikroskopi

Objekter mindre end omkring 0,2 µm, som for eksempel vira eller den interne struktur i celler, kan kun undersøges med et elektronmikroskop. I elektronmikroskoper, bruges en stråle af elektroner, i stedet for lys. Ligesom lys, bevæger elektroner sig i bølger. Opløsningsevnen for elektronmikroskoper, er meget højere end de øvrige mikroskoper beskrevet indtil videre. Den bedre opløsning i elektronmikroskoper, er på grund af den kortere bølgelængde som elektroner har; bølgelængderne for elektroner er omkring 100.000 gange mindre end bølgelængderne for synligt lys. Derfor, bruges elektronmikroskoper, til undersøgelse af strukturer der er for små til at kunne ses i lysmikroskoper. Billeder fremstillet af elektronmikroskoper er altid sort/hvide, men de kan farvelægges, for at fremhæve bestemte strukturer.

I stedet for at bruge glaslinser, anvender elektronmikroskopet elektromagnetiske linser til at fokusere en stråle af elektroner på emnet. Der er to typer elektronmikroskoper: transmission elektronmikroskopet og skanningselektronmiskroskopet. Opbygningen af de to elektronmikroskoptyper kan ses på figur 2.2.4.1 og 2.2.4.2.

Figur 2.2.4.1 – Transmissionselektronmikroskop – Transmissionselektronmikroskop
Figur 2.2.4.2 – Skanningselektronmikroskop

Transmissionselektronmikroskop

Figur 2.2.4.3 – Eksempel på transmissions-elektronmikroskopi

I Transmissionselektronmikroskopet (TEM), passerer en fint fokuseret stråle af elektroner fra en elektronkanon, gennem et specielt forberedt, ultratyndt sektion af emnet, se figur 2.2.4.3. Elektronstrålen bliver fokuseret på et lille område af emnet, med en elektromagnetisk kondensorlinse, der har omtrentlig den samme funktion, som kondensoren i et lysmikroskop – ensretter strømmen af elektroner i en lige linje for at oplyse emnet.

I stedet for at være placeret på et objektglas, som i lysmikroskopi, er emnet normalt placeret på kobbertrådnet. Strålen af elektroner, passerer emnet og derefter igennem en elektromagnetisk objektivlinse, der forstørrer emnet. Til sidst, bliver elektronerne fokuseret af en elektromagnetisk projektor (til forskel fra okularlinsen i et lysmikroskop) på en fluorescerende skærm, eller fotografisk plade. Det endelige billede, kaldet en transmissions elektron mikrograf, fremstår som mange lyse og mørke pletter, afhængig af antallet af elektroner der er blevet absorberet af de forskellige områder i emnet.

Transmissionselektronmikroskopet kan opløse objekter, så tæt på hinanden, som 10 pm og objekterne er typisk forstørret 10.000x til 100.000x. Fordi de fleste mikroskopiske emner er så tynde, er kontrasten imellem deres ultrastrukturer og baggrunden meget svag. Kontrasten kan væsentlig forbedres, ved at farve emnet med en stof der absorberer elektroner og giver et mørkere billede i de farvede områder. Salte af forskellige tungmetaller, som for eksempel bly, tungsten og uran, er almindeligt brugte som farvestoffer. Disse metaller kan fikseres på emnet (positiv farvning) eller bruges til at forøge elektrongennemsigtigheden i det omgivende område (negativ farvning). Negativ farvning, er særdeles brugbar, når man studerer de mindste emner, som for eksempel viruspartikler, bakteriers flageller og proteinmolekyler.

Figur 2.2.4.4 – Eksempel på shadow casting transmissionselektron-mikroskopi

I tillæg til positiv og negativ farvning, kan en mikroorganisme ses ved en teknik kaldet shadow casting. Ved denne metode, sprøjtes et tungt metal, som for eksempel platin eller guld, på emnet i en vinkel på omkring 45º. Herved rammes mikroorganismen kun fra den ene side. Metallet ophober sig på den ene side af emnet og det ikke-coatede område på den modsatte side af emnet, efterlader et klart område bag det, som en skygge. Dette giver en tredimensionel effekt til emnet og giver en generel ide om størrelsen og formen på emnet. Se figur 2.2.4.4.

Transmissionselektronmikroskopi, har en høj opløsning og er særdeles værdifuldt til undersøgelse af de forskellige lag af emnerne. Det har dog visse ulemper. Fordi elektroner har en begrænset gennemtrængningsevne, kan kun meget tynde sektioner af et emne (omkring 100 nm) studeres effektivt. Derfor har emnet ikke noget tredimensionelt aspekt. Derudover, skal emnet være fikseret, dehydreret og skal ses under kraftigt vakuum for at forhindre elektronernes spredning. Disse behandlinger, ikke alene dræber emnet, men skaber også skrumpning og forvrængning, til tider i en sådan grad, at det ser ud som om cellen indeholder yderligere strukturer end i virkeligheden. Strukturer der fremkommer som følge af forberedelsen af emnet, kaldes for artefakter (artifacts).

Skanningselektronmikroskopi

Figur 2.2.4.5 – Eksempel på skanningselektronmikroskopi

Skanningselektronmikroskopet (SEM) overvinder sektionerings-problemerne forbundet med transmissionselektronmikroskopet. Det giver bemærkelsesværdige tredimensionelle billeder af emnet. En elektronkanon fremstiller en fin fokuseret elektronstråle, kaldet den primære elektronstråle. Disse elektroner passerer gennem elektromagnetiske linser og bliver dirigeret hen over overfladen på emnet. Den primære elektronstråle, slår elektroner ud af overfladen på emnet og de sekundære elektroner der herved dannes, bliver transmitteret til en elektronopsamler, bliver forstærket og bliver brugt til at danne et billede på en visningsskærm eller en fotografisk plade. Billedet kaldet for et skanningselektron mikrograf. Dette mikroskop er specielt brugbart ved studier af overfladestrukturerne på intakte celler og vira. I praksis, kan det opløse objekter så tæt på hinanden som 10 nm og objekterne forstørres generelt mellem 1.000x og 10.000x. Se figur 2.2.4.5.

2.2.5 Skanning Probe Mikroskopi

Siden først i 1980’erne, er der blevet udviklet flere nye typer mikroskoper, kaldet skanning probe mikroskoper. De bruger forskellige typer sonder (probes) til at undersøge overfladen af et emne, ved brug af elektricitet, som ikke ødelægger eller ændrer emnet eller udsætter det for skadende, højenergisk stråling. Sådanne mikroskoper, kan bruges til at kortlægge atomiske og molekylære former, til at karakteriserer magnetiske og kemiske egenskaber og til at bestemme temperaturvariationer inde i cellerne. Blandt de nye typer af skanning probe mikroskoper, beskrives skanning tunnel mikroskopet og atomisk kraft mikroskopet her.

Skanning Tunnel Mikroskopi

Figur 2.2.5.1 – Eksempel på skanning tunnel mikroskopi af et DNA molekyle

Skanning tunnel mikroskopi (STM) bruger en tynd tungstenssonde, der skanner en prøve og fremstiller et billede der afslører buler og fordybninger af atomerne på emnets overflade. Se figur 2.2.5.1. Skanning tunnel mikroskopet har en opløsning der er meget større end et elektronmikroskop; Det kan skelne elementer der er omkring 1/100 del af størrelsen på et atom. Desuden er speciel forberedelse af emnet ikke nødvendig. Skanning tunnel mikroskopet bruges til at fremstille utrolig detaljerede billeder af molekyler, så som DNA.

Atomisk Kraft Mikroskopi

Figur 2.2.5.2 – Eksempel på atomisk kraft mikroskopi af tobaksmosaikvirus

Ved atomisk kraft mikroskopi (AKM), bliver en metal-diamant sonde, forsigtigt tvunget ned på et emne. Som sonden bevæger sig langs med overfladen på emnet, bliver dens bevægelser optaget og et tredimensionelt billede fremstilles. Se figur 2.2.5.2. Som med skanning tunnel mikroskopi, behøver emnet ikke nogen særlig forberedelse ved atomisk kraft mikroskopi. Atomisk kraft mikroskopi, bruges til at fremstille billeder af biologiske materialer (i næsten atomar detalje) og molekylære processer (som for eksempel samlingen af fibrin, et komponent i blodets størkningsproces).

 

2.3 – Forberedelse af emner til lysmikroskopi →