De fleste mikroorganismer fremstår næsten farveløse, når de ses gennem et normalt lysmikroskop, så man er nødt til at forberede dem når de skal observeres. En måde er ved at farve emnet.
2.3.1 Forberedelse af udstrygninger til farvning
De første observationer af mikroorganismer er normalt som farvede præparater. Ved farvning, farver man ganske enkelt mikroorganismerne med et farvestof, der fremhæver bestemte strukturer. Før mikroorganismerne kan farves, skal de dog først fikseres (fastgøres) til objektglasset. Fiksering dræber øjeblikkeligt mikroorganismerne, samtidig med at de fastgøres til objektglasset. Fiksering bevarer også de forskellige dele af mikroorganismerne i deres naturlige tilstand med minimal forvrængning.
Når en prøve skal fikseres, spredes en tynd film af materiale indeholdende mikroorganismerne, hen over overfladen på objektglasset. Denne film, kaldet for en udstrygning, lader man lufttørre. I de fleste farveprocedurer fikseres objektglasset ved at føres det igennem flammen på en bunsenbrænder adskillige gange, med udstrygningsfladen opad, eller ved at dække objektglasset med metanol i et minut. Farvestoffet påføres og skylles derefter af med vand, hvorefter objektglasset dækkes med absorberende papir. Uden fiksering, risikerer man at vaske mikroorganismerne af med farvestoffet eller afskylningen. De farvede mikroorganismer, er herefter klar til mikroskopisk undersøgelse.
Farvestofferne er salte, sammensat af en positiv og en negativ ion og en af disse er farvede og kendt som en kromofor. Farven i de såkaldte basiske farvestoffer findes i kationen; i sure farvestoffer er det anionen der er farvet. Bakterier er svagt negativt ladede ved pH 7. Derfor bliver den farvede kation i basiske farvestoffer, tiltrukket af den negativt ladede bakterie. Basiske farvestoffer, inkluderer blandt andet krystalviolet, methylenblåt, malakitgrønt og safranin. Sure farvestoffer, tiltrækkes ikke af de fleste typer bakterier, fordi farvestoffets negative ioner bliver frastødt af de negativt ladede bakterieoverflader, så de farver baggrunden i stedet. Forberedelse af farveløse bakterier mod en farvet baggrund, kaldes for negativ farvning eller kontrastfarvning. Dette er værdifuldt i forhold til iagttagelse af celleformer, størrelser og kapsler, fordi cellerne gøres tydelige mod den kontrastfarvede mørke baggrund. Se figur 2.3.1.1. Forvrængning af cellestørrelse og –form formindskes, da fiksering ikke er nødvendig og cellerne ikke optager farvestoffet. Eksempler på sure farvestoffer inkluderer eosin, fuchsin og nigrosin.
For at anvende sure eller basiske farvestoffer, bruger mikrobiologer tre forskellige farvemetoder; simpel, differential- og specialfarvning.
2.3.2 Simpel farvning
En simpel farvning er en vandig eller alkoholisk opløsning af et enkelt basisk farvestof. Selvom forskellige farvestoffer binder sig specifikt til forskellige dele af cellerne, er det primære formål med simpel farvning, at fremhæve hele mikroorganismen, så den cellulære form og de grundlæggende strukturer bliver synlige. Se figur 2.3.2.1. Farvestoffet tilføres på den fikserede udstrygning i en foruddefineret mængde og tid og vaskes herefter af. Objektglasset tørres og iagttages herefter. Sommetider tilføjes et kemikalie til opløsningen, for at intensivere farvningen; et sådan additiv, kaldes et bejdsemiddel. En funktion af bejdsemidlet, er at øge affiniteten af farvestoffet til en biologisk prøve; en anden funktion er at coate en særlig struktur (for eksempel en flagel) får at gøre den tykkere og lettere at se, efter den er blevet farvet med et farvestof. Nogle af de simple farvestoffer, der ofte anvendes i laboratoriet er methylenblåt, karbolfuchsin, krystalviolet og safranin.
2.3.3 Differentialfarvning
Ulig simpel farvning, reagerer differentialfarvning forskelligt med forskellige slags bakterier og kan derfor bruges til at skelne dem fra hinanden. De hyppigste differentialfarvninger der anvendes er Gramfarvning og syrefastfarvning.
Gramfarvning
Gramfarvningen blev udviklet i 1884, af den danske mikrobiolog Hans Christian Gram. Det er en af de mest anvendelige farveprocedurer fordi den klassificerer bakterier i to store grupper; grampositive og gramnegative. Se figur 2.3.3.1 for illustration af fremgangsmåden og under denne for beskrivelsen af fremgangsmåden.
1. En flammefikseret udstrygning, dækkes med et basisk violet farvestof, normalt krystalviolet. Da det violette farvestof overfører sin farve til alle celler, kaldes den for det primære farvestof.
2. Efter kort tid, vaskes det violette farvestof af og udstrygningen dækkes med en iodopløsning, en bejdse. Normalt anvendes en iod-iodkalium opløsning. Når iodopløsningen vaskes af, fremstår både grampositive og gramnegative bakterier mørkviolette.
3. Herefter, vasket objektglasset med ethanol, eller en ethanol-acetone opløsning. Denne opløsning kaldes for en affarvningsreagens, der fjerner den violette farve fra nogle arter men ikke fra andre.
4. Ethanolen vaskes herefter af, og objektglasset farves herefter med safranin, et basisk rødt farvestof. Udstrygningen vaskes igen og duppes tør med absorberende papir inden mikroskopering af prøven foretages.
Den violette farve og iodet, kombineres i hver bakteries cytoplasma og farver den mørklilla. Bakterier der bibeholder denne farve efter ethanolen har forsøgt at affarve dem, bliver klassificeret som grampositive; bakterier der mister den mørkviolette farve efter affarvningen bliver klassificeret som gramnegative. Se figur 2.3.3.2. Fordi gramnegative bakterier er farveløse efter affarvningen, er de ikke længere synlige. Det er derfor det basiske farvestof safranin anvendes bagefter; det gør de gramnegative bakterier pink eller lyst røde. Farvestoffer som safranin er en kontrastfarve til det primære farvestof, kaldes for modfarvestoffer eller kontrastfarvestoffer. Fordi de grampositive bakterier bibeholder den violette farve, påvirkes de ikke af safraninkontrastfarvningen.
Som det bliver beskrevet senere, reagerer forskellige typer bakterier, forskelligt på gramfarvningen på grund af strukturelle forskelle i deres cellevægge, der påvirker bevarelsen eller frigivelsen af kombinationen mellem krystalviolet og iod, som kaldes for krystalviolet-iod komplekset. Blandt andre forskelle, har grampositive bakterier, en tykkere peptidoglycan cellevæg (disaccharider og aminosyrer) end gramnegative bakterier. Derudover har gramnegative bakterier et lag af lipopolysaccharid (lipider og polysaccharider), som en dels af deres cellevæg. Når krystalviolet og herefter iodopløsningen, anvendes på grampositive og gramnegative celler, trænger krystalviolet og iod let ind i cellerne. Inde i cellerne danner krystalviolet og iod det tidligere nævnte krystalviolet-iod kompleks. Dette kompleks er større end krystalvioletmolekylet. På grund af dets størrelse, kan det ikke udvaskes gennem det intakte peptidoglycan lag på grampositive bakterier med ethanol. Som konsekvens heraf bibeholder grampositive bakterier farven fra krystalviolet. I gramnegative bakterier, forstyrrer afvaskningen med ethanol, det ydre lipopolysaccheridlag og krystalviolet-iod komplekset vaskes ud gennem det tynde lag peptidoglycan. Som resultat heraf, er gramnegative celler farveløse indtil de kontrastfarves med safranin, hvorefter de fremstår pink eller lyst røde.
Grammetoden, er en af de vigtigste farveteknikker i medicinsk mikrobiologi. Men Gramfarvnings-resultater er ikke universelt anvendelige, fordi nogle bakterieceller farves dårligt eller slet ikke. Gramreaktionen er mest konsistent, når den bruges på unge, voksende bakterier.
Gramreaktionen for en bakteriecelle, kan give værdifuld information om behandlingen af sygdommen, Grampositive bakterier har tendens til, nemt at blive dræbt af penicilliner og cephalosporiner. Gramnegative bakterier, er generelt mere resistente fordi antibiotika har svært ved at gennemtrænge lipopolysaccharidlaget. Resistens mod disse antibiotika blandt både Grampositive og gramnegative bakterier, er på grund af bakterierne inaktiverer antibiotikaene.
Syrefast farvning
En anden vigtig differentialfarvning (en farvning der differentierer bakterier i distinktive grupper), er syrefast farvning, der kun bindes stærkt til bakterier der har voksligninende stoffer i deres cellevægge. Mikrobiologer bruger denne metode til at identificere alle bakterier i slægten Mycobacterium, blandt andet de to vigtige patogener Mycobacterium tuberculosis, som forårsager tuberkulose og Mycobacterium leprae der forårsager spedalskhed. Metoden bruges også til identifikation af bakterier fra slægten Nocardia. Bakterierne i slægten Mycobacterium og Nocardia er syrefaste.
I metoden for syrefast farvning, tilsættes det røde farvestof karbolfuchsin, til en fikseret udstrygning og opvarmes forsigtigt i flere minutter (opvarmning forstærker optagelsen og tilbageholdelsen af det røde farvestof). Herefter afkøles objektglasset og afskylles med vand. Udstrygningen behandles herefter med en syre-alkohol opløsning, en affarver, der fjerner den røde farve fra bakterier der ikke er syrefaste. De syrefaste bakterier bibeholder den lyserøde eller røde farve, fordi karbolfuchsin er bedre opløseligt i cellevæggenes lipid, end i syre-alkohol opløsningen. Se figur 2.3.3.3. I ikke-syrefaste bakterier, hvis celler mangler lipidkomponenter, udvaskes karbolfuchsin hurtigt under affarvningen og efterlader cellerne farveløse. Ikke-syrefaste bakterier fremstår blå efter kontrastfarvningen.
2.3.4 Specialfarvning
Specialfarvning bruges til at farve dele af mikroorganismer, som for eksempel endosporer (sporer), flageller eller kapsler.
Negativfarvning af kapsler
Mange mikroorganismer indeholder en galentinøs belægning kaldet en kapsel. I medicinsk mikrobiologi, er påvisning af en kapsel et middel til påvisning af mikroorganismens virulens, i hvilken grad mikroorganismen kan forårsage sygdom.
Kapselfarvning er er sværere end andre farvningsmetoder, fordi materialerne kapslen består af er vandopløselige og kan fjernes eller opløses ved heftig vaskning. For at påvise tilstedeværelsen af kapsler, kan mikrobiologen blande bakterierne med en blanding der indeholder en fin kolloid suspension af farvede partikler (typisk india ink eller nigrosin) for at give en kontrasterende baggrund og herefter farve med et simpelt farvestof, som for eksempel safranin. På grund af deres kemiske sammensætning, optager kapsler stort set ikke nogle biologiske farvestoffer, som for eksempel safranin og vil derfor fremkomme som haloer omkring hver farvede bakteriecelle. Se figur 2.3.4.1.
Endospore (spore) farvning
En endospore er en særlig resistent, hvilende struktur, dannet inde i en celle, som beskytter bakterien mod ugunstige miljømæssige betingelser. Selvom endosporer er relativt ualmindelige i bakterier, kan de dannes af få genera af bakterier. Endosporer kan ikke farves med almindelige metoder som for eksempel simpel farvning eller Gramfarvning, fordi farvestofferne ikke kan gennemtrænge endosporernes vægge.
Den mest almindeligt anvendte endospore farvning, er Schaeffer-Fultons endospore farvning. Se figur 2.3.4.2. Malakitgrønt, som er den primære farve, tilføres til en varmefikseret udstrygning og opvarmes så prøven begynder at dampe, i omkring 5 minutter. Varmen hjælper farvestoffet med at trænge igennem endosporernes vægge. Herefter vaskes præparatet i omkring 30 sekunder med vand for at fjerne malakitgrønt fra alle cellens dele, undtaget endosporerne. Herefter tilføres safranin, en kontrastfarve, til udstrygningen, for at farve dele af cellen undtaget endosporerne. I en korrekt forberedt udstrygning, vil endosporer fremstå som grønne, men lyserøde eller røde celler. Fordi endosporer er meget refraktive, kan de ses under lysmikroskopet i ufarvet stand, men uden en specialfarvning, er det ikke muligt at differentiere dem fra inklusioner af andet opbevaret materiale i cellerne.
Flagelfarvning
Bakterieflageller (Ental = flagel) er fremdriftsstrukturer der er forsmå til at blive set under lysmikroskopet uden farvning. En besværlig og delikat farvningsprocedure, bruger en bejdse og farvestoffet karbolfuchsin til at bygge diameteren på flagellerne op, indtil de bliver synlige i lysmikroskopet. Se figur 2.3.4.3. Mikrobiologer bruger placeringen og antallet af flageller til diagnostisk hjælp.