2.4 – Iagttagelse af mikroorganismer gennem mikroskop – Resumé
Kapitelresumé
2.1 Måleenheder
Mikroorganismer måles i mikrometer, µm (10-6 m) og i nanometer, nm (10-9 m).
2.2 Mikroskopi, instrumenterne
Et simpelt mikroskop består af en linse; et sammensat mikroskop har flere linser.
2.2.1 Lysmikroskopi
Det mest almindelige mikroskop, der anvendes i mikrobiologi, er det sammensatte lysmikroskop.
Den samlede forstørrelse af et objekt, beregnes ved at gange forstørrelsen af objektivlinsen med forstørrelsen af okularlinsen.
Det sammensatte lysmikroskop, anvender synligt lys.
Den maksimale opløsning, eller opløsningsevnen (evnen til at skelne mellem to punkter) for et sammensat lysmikroskop er 0,2 µm; den maksimale forstørrelse er 2.000x.
Prøver er farvet for at øge forskellen mellem brydningsindekserne for henholdsvis prøven og mediet.
Immersionsolie anvendes med immersionsolielinsen for at reducere lystabet mellem objektglas og linse.
Brightfield belysning anvendes til farvede udstrygninger.
Ufarvede celler, kan bedre iagttages ved hjælp af darkfield”, fase-kontrast eller DIC mikroskopi.
Darkfield mikroskopet viser en lys silhuet af en organisme, mod en mørk baggrund. Det er mest anvendeligt til påvisning af tilstedeværelsen af ekstremt små organismer.
Et fase-kontrastmikroskop direkte og reflekterede eller diffrakterede lysstråler sammen (i fase) for at danne et billede af prøven på den okulære linse.
DIC mikroskopet, giver et farvet, tredimensionelt billede af levende celler.
I fluorescensmikroskopi, farves prøver først med fluorokromer og betragtes derefter gennem et sammensat lysmikroskop ved anvendelse af en ultraviolet lyskilde.
Mikroorganismerne fremstår som lyse objekter mod en mørk baggrund.
Fluorescensmikroskopi anvendes primært i en diagnostisk procedure, kaldet fluorescens antistof teknik, eller immunfluorescens.
I konfokal mikroskopi, er en prøve farvet med et fluorescerende farvestof og belyst af lys med en kort bølgelængde.
Brug af en computer til at behandle billederne, kan fremstille to- og tredimensionelle billeder af celler.
2.2.2 To foton mikroskopi
I to foton mikroskopi, er en levende prøve farvet med et fluorescerende farvestof og belyst af lys med en lang bølgelængde.
2.2.3 Skanning akustisk mikroskopi
Skanning akustisk mikroskopi, er baseret på en fortolkning af lydbølger, gennem en prøve.
Det benyttes til at undersøge levende celler bundet til overflader, for eksempel biofilm.
2.2.4 Elektronmikroskopi
I stedet for lys, bruges en stråle af elektroner i et elektronmikroskop.
I stedet for linser af glas, styrer elektromagneter fokus, belysning og forstørrelse.
Tynde snit af mikroorganismer kan ses i et elektromikrografi ved brug af et transmissions elektronmikroskop. Forstørrelse: 10.000-100.000x. opløsningsevne: 10 pm.
Tredimensionelle visninger af overfladerne på hele mikroorganismer, kan opnås med et skanningselektronmikroskop. Forstørrelse: 1.000-10.000x. Opløsningsevne: 10 nm.
2.2.5 Skanning Probe Mikroskopi
Skanning tunnel mikroskopi og atomisk kraft mikroskopi, danner tredimensionelle billeder af overfladen på et molekyle.
2.3 Forberedelse af emner til lysmikroskopi
2.3.1 Forberedelse af udstrygninger til farvning
Farvning betyder farvelægning af en mikroorganisme med et farvestof, for at gøre nogle strukturer mere tydelige.
Fiksering anvender varme eller alkohol, for at dræbe og fastgøre mikroorganismer til et objektglas.
En udstrygning, er en tynd film af materiale, der anvendes til mikroskopiske undersøgelser.
Bakterier er negativt ladede og den farvede positive ion af et basisk farvestof, vil derfor farve bakterieceller.
Den farvede negative ion af et surt farvestof, vil farve baggrunden på en bakteriel udstrygning; og en negativfarvning fremstilles.
2.3.2 Simpel farvning
En simpel farvning, er en vandig eller alkoholisk opløsning af et enkelt basisk farvestof.
Et bejdsemiddel kan anvendes for at forbedre bindingen mellem farven og prøven.
2.3.3 Differentialfarvning
Differentialfarvning, som for eksempel Gramfarvning og syrefastfarvning, differentierer bakterierne efter deres reaktioner på farvningen.
Gramfarvningsproceduren, bruger et violet farvestof, jod som bejdsemiddel, en alkohol som affarver og en rød kontrastfarve.
Grampositive bakterier forbliver violette efter affarvning; Gramnegative bakterier mister den violette farve og fremstår røde på grund af kontrastfarven.
Syrefaste mikroorganismer, som for eksempel medlemmer af slægten Mycobacterium og Nocardia, fastholder farven fra karbolfuchsin efter syre-alkohol affarvning og bliver røde; ikke-syrefaste mikroorganismer optager methylenblåt som anvendes til kontrastfarvning og bliver blå.
2.3.4 Specialfarvning
Negativfarvning, anvendes for at gøre mikrobielle kapsler synlige.
Endosporefarvning og flagelfarvning er særlige farvemetoder, der bruges for at visualisere specifikke strukturer i bakterieceller.