Kapitelresumé |
2.1 Måleenheder
- Mikroorganismer måles i mikrometer, µm (10-6 m) og i nanometer, nm (10-9 m).
2.2 Mikroskopi, instrumenterne
- Et simpelt mikroskop består af en linse; et sammensat mikroskop har flere linser.
2.2.1 Lysmikroskopi
- Det mest almindelige mikroskop, der anvendes i mikrobiologi, er det sammensatte lysmikroskop.
- Den samlede forstørrelse af et objekt, beregnes ved at gange forstørrelsen af objektivlinsen med forstørrelsen af okularlinsen.
- Det sammensatte lysmikroskop, anvender synligt lys.
- Den maksimale opløsning, eller opløsningsevnen (evnen til at skelne mellem to punkter) for et sammensat lysmikroskop er 0,2 µm; den maksimale forstørrelse er 2.000x.
- Prøver er farvet for at øge forskellen mellem brydningsindekserne for henholdsvis prøven og mediet.
- Immersionsolie anvendes med immersionsolielinsen for at reducere lystabet mellem objektglas og linse.
- Brightfield belysning anvendes til farvede udstrygninger.
- Ufarvede celler, kan bedre iagttages ved hjælp af darkfield”, fase-kontrast eller DIC mikroskopi.
- Darkfield mikroskopet viser en lys silhuet af en organisme, mod en mørk baggrund. Det er mest anvendeligt til påvisning af tilstedeværelsen af ekstremt små organismer.
- Et fase-kontrastmikroskop direkte og reflekterede eller diffrakterede lysstråler sammen (i fase) for at danne et billede af prøven på den okulære linse.
- DIC mikroskopet, giver et farvet, tredimensionelt billede af levende celler.
- I fluorescensmikroskopi, farves prøver først med fluorokromer og betragtes derefter gennem et sammensat lysmikroskop ved anvendelse af en ultraviolet lyskilde.
- Mikroorganismerne fremstår som lyse objekter mod en mørk baggrund.
- Fluorescensmikroskopi anvendes primært i en diagnostisk procedure, kaldet fluorescens antistof teknik, eller immunfluorescens.
- I konfokal mikroskopi, er en prøve farvet med et fluorescerende farvestof og belyst af lys med en kort bølgelængde.
- Brug af en computer til at behandle billederne, kan fremstille to- og tredimensionelle billeder af celler.
2.2.2 To foton mikroskopi
- I to foton mikroskopi, er en levende prøve farvet med et fluorescerende farvestof og belyst af lys med en lang bølgelængde.
2.2.3 Skanning akustisk mikroskopi
- Skanning akustisk mikroskopi, er baseret på en fortolkning af lydbølger, gennem en prøve.
- Det benyttes til at undersøge levende celler bundet til overflader, for eksempel biofilm.
2.2.4 Elektronmikroskopi
- I stedet for lys, bruges en stråle af elektroner i et elektronmikroskop.
- I stedet for linser af glas, styrer elektromagneter fokus, belysning og forstørrelse.
- Tynde snit af mikroorganismer kan ses i et elektromikrografi ved brug af et transmissions elektronmikroskop. Forstørrelse: 10.000-100.000x. opløsningsevne: 10 pm.
- Tredimensionelle visninger af overfladerne på hele mikroorganismer, kan opnås med et skanningselektronmikroskop. Forstørrelse: 1.000-10.000x. Opløsningsevne: 10 nm.
2.2.5 Skanning Probe Mikroskopi
- Skanning tunnel mikroskopi og atomisk kraft mikroskopi, danner tredimensionelle billeder af overfladen på et molekyle.
2.3 Forberedelse af emner til lysmikroskopi
2.3.1 Forberedelse af udstrygninger til farvning
- Farvning betyder farvelægning af en mikroorganisme med et farvestof, for at gøre nogle strukturer mere tydelige.
- Fiksering anvender varme eller alkohol, for at dræbe og fastgøre mikroorganismer til et objektglas.
- En udstrygning, er en tynd film af materiale, der anvendes til mikroskopiske undersøgelser.
- Bakterier er negativt ladede og den farvede positive ion af et basisk farvestof, vil derfor farve bakterieceller.
- Den farvede negative ion af et surt farvestof, vil farve baggrunden på en bakteriel udstrygning; og en negativfarvning fremstilles.
2.3.2 Simpel farvning
- En simpel farvning, er en vandig eller alkoholisk opløsning af et enkelt basisk farvestof.
- Et bejdsemiddel kan anvendes for at forbedre bindingen mellem farven og prøven.
2.3.3 Differentialfarvning
- Differentialfarvning, som for eksempel Gramfarvning og syrefastfarvning, differentierer bakterierne efter deres reaktioner på farvningen.
- Gramfarvningsproceduren, bruger et violet farvestof, jod som bejdsemiddel, en alkohol som affarver og en rød kontrastfarve.
- Grampositive bakterier forbliver violette efter affarvning; Gramnegative bakterier mister den violette farve og fremstår røde på grund af kontrastfarven.
- Syrefaste mikroorganismer, som for eksempel medlemmer af slægten Mycobacterium og Nocardia, fastholder farven fra karbolfuchsin efter syre-alkohol affarvning og bliver røde; ikke-syrefaste mikroorganismer optager methylenblåt som anvendes til kontrastfarvning og bliver blå.
2.3.4 Specialfarvning
- Negativfarvning, anvendes for at gøre mikrobielle kapsler synlige.
- Endosporefarvning og flagelfarvning er særlige farvemetoder, der bruges for at visualisere specifikke strukturer i bakterieceller.