Et næringsstofmedie udarbejdet til vækst af mikroorganismer i et laboratorium, kaldes et dyrkningsmedie. Nogle bakterier, kan vokse godt på næsten alle dyrkningsmedier; andre kræver særlige medier og andre igen kan ikke vokse på nogle ikkelevende medier der endnu er udviklet. Mikroorganismer der overføres til et dyrkningsmedie for at igangsætte vækst, kaldes et inokulum. Mikroorganismerne der formerer sig i eller på et dyrkningsmedie, omtales som en kultur.
Hvis vi antager, at vi ønsker at dyrke en kultur af en bestemt mikroorganisme, måske en mikroorganisme fra en bestemt klinisk prøve, hvilke kriterier skal dyrkningsmediet så opfylde? For det første, skal det indeholde de rigtige næringsstoffer for den specifikke mikroorganisme vi ønsker at dyrke. Det bør også indeholde tilstrækkeligt med fugt, korrekt justeret pH og et passende niveau af oxygen, eller slet intet. Mediet skal i første omgang være sterilt – der betyder, at det ikke må indeholde nogle levende mikroorganismer – så kulturen kun vil indeholde de mikroorganismer (og deres afkom), som vi tilfører dyrkningsmediet. Endelig skal den voksende kultur inkuberes ved den rette temperatur.
En lang række dyrkningsmedier er tilgængelige for væksten af mikroorganismer i laboratoriet. De fleste af disse dyrkningsmedier, der er tilgængelige fra kommercielle kilder, er forblandede komponenter og kræver kun tilsætning af vand og efterfølgende sterilisering. Dyrkningsmedierne udvikles løbende eller revideres til brug for isolering og identifikation af bakterier der har interesse i forhold til områderne mad, vand og klinisk mikrobiologi.
Når det er ønskeligt at dyrke bakterier på et fast dyrkningsmedie, er der tilsat et størkningsmiddel, som for eksempel agar, til dyrkningsmediet. Agar er en sammensat polysaccharid der er udvundet af en marin alge og har længe været anvendt som fortykningsmiddel i fødevarer som gelé og is.
Agar har nogle meget vigtige egenskaber, der gør det værdifuldt for mikrobiologien og der er endnu ikke fundet nogen anden tilfredsstillende erstatning for agar. Få mikroorganismer kan nedbryde agar, så det forbliver et fast stof. Agar smelter ved cirka 100 ºC og forbliver flydende, indtil temperaturen falder til omkring 40 ºC. Til laboratoriebrug, holdes agar flydende i vandbade ved cirka 50 ºC. Ved denne temperatur, tager de fleste bakterier ikke skade, når den hældes over dem. Når agaren er størknet, kan den inkuberes ved temperaturer helt op til tæt på 100 ºC, før den igen bliver flydende. Denne egenskab er særlig nyttig, når termofile bakterier dyrkes.
Agarmedierne findes som regel i reagensglas eller i petriskåle. Reagensglassene kaldes for skråsubstrater, da deres indhold får lov til at størkne mens de holdes i en vinkel, således at et stort overfladeareal til vækst opnås. Når agaren størkner i et lodret rør, kaldes det for et dyp. Petriskåle, opkaldt efter deres opfinder, er flade skåle med et låg der ligger over bunden for at forhindre forurening; når de er fyldt med dyrkningsmedie, kaldes de for petri (eller kultur) plader.
5.3.1 Kemisk definerede dyrkningsmedier
For at understøtte mikrobiel vækst, skal et dyrkningsmedie tilvejebringe en energikilde, samt kilder til kulstof, nitrogen, svovl, phosphor og alle organiske vækstfaktorer organismen selv er ude af stand til at syntetisere. Et kemisk defineret dyrkningsmedie er et, hvis nøjagtige kemiske sammensætning er kendt. For en kemoheterotrof, skal dyrkningsmediet indeholde organiske vækstfaktorer, der tjener som en kilde til kulstof og energi. Et eksempel er vist i tabel 5.3.1.1, hvor glucose er inkluderet i dyrkningsmediet, for at understøtte dyrkning af den kemoheterotrofe E. coli.
Som tabel 5.3.1.2 viser, skal mange organiske vækstfaktorer være til stede i et kemisk defineret dyrkningsmedie der skal anvendes til at dyrke en art af Leuconostoc. Organismer der kræver mange vækstfaktorer, bliver beskrevet som kræsne. Organismer af denne typer, såsom Lactobacillus, anvendes undertiden i test, der bestemmer koncentrationen af et bestemt vitamin i et stof. For at udføre en sådan mikrobiologisk test, fremstilles et vækstmedium der indeholder alle vækst krav, med undtagelse af vitaminet der skal analyseres for. Så kombineres vækstmedie, teststof og bakterie og væksten af bakterien måles. Denne bakterievækst, hvilket afspejles af mængden af mælkesyre der produceres, vil være proportional med mængden af vitaminet i teststoffet. Jo mere mælkesyre der produceres, jo bedre har Lactobacillus-bakterierne været i stand til at vokse og er dermed mål for mængden af vitaminet i teststoffet.
5.3.2 Komplekse dyrkningsmedier
Kemisk definerede dyrkningsmedier er normalt forbeholdt laboratorieeksperimentelt arbejde eller til dyrkning af autotrofe bakterier. De fleste heterotrofe bakterier og svampe, som man ville arbejde med på et indledende laboratoriekursus, dyrkes rutinemæssigt på komplekse dyrkningsmedier, der består af næringsstoffer, herunder udtræk af gær, kød eller planter, eller delvist nedbrudte proteiner fra disse og andre kilder. Den nøjagtige kemiske sammensætning varierer lidt fra batch til batch. Tabel 5.3.2.1 viser en meget udbredt opskrift.
I komplekse dyrkningsmedier, bliver mikroorganismernes krav for energi, kulstof, nitrogen og svovl, primært tilvejebragt af protein. Proteiner er så store, relativt uopløselige molekyler, at kun et fåtal af mikroorganismer kan udnytte dem direkte. Delvis nedbrydning med syrer eller enzymer, reducerer proteinerne til kortere kæder af aminosyrer, kaldet peptoner. Disse små, opløselige fragmenter af proteiner, kan nemt optages og udnyttes af de fleste bakterier.
Vitaminer og andre organiske vækstfaktorer, leveres af kød- eller gærekstrakter. De opløselige vitaminer og mineraler fra kød eller gær, opløses det ekstraherende vand, som herefter inddampes, så disse faktorer koncentreres (disse ekstrakter, supplerer også de organiske nitrogen- og kulstofforbindelser). Gærekstrakter, er særligt rige på B-vitaminer. Hvis et komplekst dyrkningsmedie er flydende, kaldet det ”Nutrient Broth” (eller næringsbouillon). Når der tilsættes agar, kaldes det ”Nutrient Agar” (eller næringsagar). Denne terminologi kan godt være lidt forvirrende, bare husk på at agar ikke selv er et næringsstof.
5.3.3 Anaerobe dyrkningsmedier og –metoder
Dyrkningen af anaerobe bakterier udgør et særligt problem. Fordi anaerobe bakterier kan blive dræbt ved udsættelse for oxygen, skal specialmedier, kaldet reducerende medier anvendes. Disse medier indeholder ingredienser, såsom natriumthioglyconat, der kemisk binder sig med opløst oxygen i dyrkningsmediet og nedbryder det. For rutinemæssigt at dyrke og opretholde rene obligat anaerobe kulturer, bruger mikrobiologer reducerende dyrkningsmedier, opbevaret i almindelige tætlukkede reagensglas. Disse medier opvarmes kort før brug for at drive absorberet oxygen ud.
Når kulturen skal dyrkes i petriskåle for at observere individuelle kolonier, er der flere metoder til rådighed. Laboratorier, der arbejder med relativt få dyrkningsplader ad gangen, kan bruge systemer der kan inkubere mikroorganismerne i forseglede kasser og krukker, hvorfra oxygen er fjernet kemiske efter dyrkningspladerne er lagt i og beholderen forseglet som vist i figur 5.3.3.1. Posen med kemikalier (den aktive bestanddel er ascorbinsyre), åbnes simpelthen for at give kontakt til det oxygen der er i beholderen. Atmosfæren i en sådan beholder, indeholder sædvanligvis mindre end 5% oxygen, 18% kuldioxid og inden hydrogen. I en nyligt indført system, bliver de enkelte petriskåle (OxyPlate) til et anaerobt kammer. Dyrkningsmediet i pladen indeholder et enzym, oxyrase, som kombinerer oxygen med hydrogen og danner vand.
Laboratorier, der har en stor mængde af arbejde med anaerobe kulturer, bruger ofte et anaerobt kammer, som vist i figur 5.3.3.2. Kammeret er fyldt med inaktive gasser (typisk cirka 85% N2, 10% H2 og 5% CO2) og er udstyret med luftsluser til at indføre kulturer og materialer igennem.
5.3.4 Specielle dyrkningsteknikker
Mange bakterier er aldrig succesfuldt, blevet dyrket på kunstige laboratoriedyrkningsmedier. Mycobacterium leprae, bakterien der forårsager spedalskhed, bliver nu sædvanligvis dyrket i bæltedyr, som har en relativt lav kropstemperatur, der matcher kravene for bakterien. Et andet eksempel er syfilis spirocheten, selvom visse ikkepatogene stammer af denne bakterie er dyrket på laboratoriedyrkningsmedier. Med få undtagelser har de obligat intracellulære bakterier, som for eksempel Rickettsia og chlamydia, ikke kunnet vokse på kunstige dyrkningsmedier. Ligesom virus, kan de kun reproducere sig inde i en levende værtscelle.
Mange kliniske laboratorier har særlige kuldioxidinkubatorer til at dyrke aerobe bakterier, der kræver koncentrationer af CO2 højere eller lavere end den der findes i atmosfæren. Det ønskede CO2-niveau opretholdes med elektronisk styring. Høje CO2-niveauer, kan også opnås med simple stearinlyskrukker. Kulturen placeres i en stor forseglet beholder, indeholdende et tændt stearinlys der forbruger oxygenet. Lyset holder op med at brænde, når luften i krukken har en lavere koncentration af oxygen end i normal luft (omkring 17% O2, der stadig er nok til vækst af aerobe mikroorganismer). En forhøjet koncentration af CO2 er også til stede på grund af forbrændingen fra lyset. Mikroorganismer, der vokser bedre ved høje CO2-koncentrationer, kaldes for capnofile. Den lave oxygenkoncentration og høje CO2-koncentration, ligner de forhold der findes i tarmkanalen, luftvejene og andre væv. Hvor sygdomsfremkaldende bakterier vokser.
Stearinlyskrukker, bruges stadig lejlighedsvis, men oftere bruges kommercielt tilgængelig kemiske pakker, til at generere kuldioxidatmosfærer i beholdere. Når kun en eller to petriskåle skal inkuberes, bruger kliniske laboratorier ofte, små plasticposer med selvstændige kemiske gasgeneratorer, der aktiveres ved at knuse pakkens indhold, eller tilsætte et par mL vand. Disse pakker er undertiden specialdesignede til at give præcise koncentrationer af kuldioxid (normalt højere end den der kan opnås i stearinlyskrukker) og oxygenkoncentrationer til dyrkning af mikroorganismer, som for eksempel den mikroaerofile Camphylobacter-bakterie.
Nogle mikroorganismer, såsom Ebola-virus, er så farlige at de kun håndteres under ekstraordinære systemer til inddæmning, kaldet biosikkerhedsniveau 4 (Bio Safety Level 4 eller BSL-4). Laboratoriet er et forseglet miljø i en større bygning og har en atmosfære under negativt tryk, så aerosoler der indeholder patogener ikke kan undslippe. Både indsugningsluften og udblæsningsluften filteres gennem højeffektive partikelluftfiltre (HEPA-filter – High Efficiency Particulate Air); udblæsningsluften filtreres to gange. Alt affald der forlader laboratoriet gøres ikke-smittefarligt. Personalet der arbejder i laboratoriet bærer ”rumdragter” med ekstern luftforsyning. Se figur 5.3.4.1.
Mindre farlige mikroorganismer, bliver håndteret på lavere niveauer af biosikkerhed. For eksempel ville et grundlæggende mikrobiologilaboratorium på for eksempel en skole være et BSL-1 laboratorium. Mikroorganismer, der udgør en moderat risiko for infektion, håndteres på et BSL-2 laboratorium. BSL-3 laboratorier, er beregnet til håndtering af meget smitsomme, luftbårne patogener, som for eksempel tuberkulosebakterien. Biologiske sikkerhedsskabe, af samme udseende som det anaerobe kammer vist i figur 5.3.3.2, anvendes. Laboratoriet selv bør have negativt atmosfærisk tryk og være udstyret med luftfiltre, der forhindrer udslip af patogener fra laboratoriet.
5.3.5 Selektive og differentielle dyrkningsmedier
I klinisk og sundhedsmikrobiologi, er det ofte nødvendigt at kunne påvise tilstedeværelsen af bestemte mikroorganismer associeret med sygdom eller dårlige sanitære forhold. Til denne opgave anvendes selektive og differentierende dyrkningsmedier. Selektive dyrkningsmedier er designet til at undertrykke væksten af uønskede mikroorganismer og fremme væksten af de ønskede mikroorganismer. For eksempel er bismuthsulfit agar et dyrkningsmedie, der anvendes til isolering af tyfusbakterien, den Gramnegative Salmonella typhi, fra fæces. Bismuthsulfit, hæmmer Grampositive bakterier og de fleste Gramnegative tarmbakterier (undtagen S. typhi). Sabourauds dextroseagar, der har en pH værdi på 5,6, anvendes til at isolere svampe, hvis vækst overgår de fleste bakteriers ved denne pH.
Differentielle dyrkningsmedier gør det lettere at skelne kolonier af den ønskede mikroorganisme fra andre kolonier der vokser på samme plade. Ligeledes har rene kulturer af mikroorganismer, identificerbare reaktioner med differentielle dyrkningsmedier i rør eller plader. Blodagar (der indeholder røde blodlegemer) er et dyrkningsmedie, mikrobiologer ofte anvender til at identificere bakteriearter, der ødelægger de røde blodlegemer. Disse arter, som for eksempel Streptococcus pyogenes der forårsager halsbetændelse, viser en klar ring omkring deres kolonier, hvor de har lyseret de røde blodlegemer (hæmolyse). Se figur 5.3.5.1.
Nogle gange er selektive og differentielle egenskaber kombineret i et enkelt dyrkningsmedie. Forestil dig, at vi ønsker at isolere den almindelige bakterie Staphylococcus aureus, der findes i næsens passager. Denne bakterie har en tolerance for høje koncentrationer af natriumchlorid; den kan også fermentere kulhydratet mannitol og danne syre. Mannitol-salt agar indeholder 7,5% natriumchlorid, der vil modvirke væksten af konkurrerende mikroorganismer og dermed selektere for (begunstige væksten af) S. aureus. Dette salt medium indeholder også en pH-indikator, der skifter farve hvis mannitol i mediet fermenteres til syre; mannitolfermenterende kolonier af S. aureus varierer således fra kolonier af bakterier, der ikke fermenterer mannitol. Bakterier, der vokser i den høje saltkoncentration og fermenterer mannitol til syre, kan let identificeres ved farveændring af dyrkningsmediet. Se figur 5.3.5.2. Disse kolonier, er sandsynligvis kolonier af S. aureus og deres identifikation kan bekræftes ved yderligere tests.
5.3.6 Berigelseskulturer
Fordi bakterier der er til stede i små mængder kan blive overset, især hvis der er andre bakterier er til stede i langt større antal, er det nogle gange nødvendigt at anvende en berigelseskultur. Dette er ofte tilfældet for jord eller fækale prøver. Dyrkningsmediet (beriget dyrkningsmedie) til en berigelseskultur, er normalt flydende og giver næringsstoffer og miljømæssige forhold der fremmer væksten af en bestemt mikroorganisme, men ikke andre. I den forstand er det også et selektivt dyrkningsmedie, men det er designet til at øge et meget lille antal af den ønskede type mikroorganisme til målbare niveauer.
Forestil dig, at vi ønsker at isolere en bestemt mikroorganisme fra en jordprøve, der er i stand til at vokse på phenol og er til stede i et meget lille antal i forhold til andre arter. Hvis jordprøven anbringes i et flydende berigelsesdyrkningsmedie, hvor phenol den eneste kilde til kulstof og energi, vil mikroorganismer der ikke er i stand til at omsætte phenol, ikke kunne vokse. Dyrkningsmediet får lov til at inkubere et par dage og herefter, bliver en lille mængde af det overført til en anden kolbe med samme dyrkningsmedium. Efter en række af disse overførsler, vil den overlevende del bakterier, bestå af bakterier der er i stand til at omsætte phenol. Bakterierne får lov til at vokse i mediet mellem overførslerne; dette kaldes berigelsesfasen. Eventuelle næringsstoffer for andre bakterier, bliver hurtigt kraftigt fortyndet ved overførslerne. Når den sidste fortynding udstryges på en fast plade af samme medium, vil kun de kolonier af bakterier i stand til at omsætte phenol, kunne vokse. Et bemærkelsesværdigt aspekt af denne særlige teknik er, at phenol normalt er dødeligt for de fleste bakterier.
Tabel 5.3.1 opsummerer formålet med de forskellige hovedtyper af dyrkningsmedier.
