At kunne repræsentere de enorme populationer, som følge af vækst af bakteriekulturer, grafisk, er en vigtig del af mikrobiologi. Det er også nødvendigt at være i stand til at bestemme antallet af mikroorganismer, enten direkte ved at tælle, eller indirekte ved måling af deres metaboliske aktivitet.
5.6.1 Bakteriedeling
Som vi nævnte tidligere i dette kapitel, refererer bakterievækst, til en stigning i antallet af bakterier, ikke forøgelsen af størrelsen af de enkelte celler. Bakterier reproducerer sig normalt ved binær fission, som vist i figur 5.6.1.2.
Få bakteriearter reproducerer sig ved knopskydning; de danner en lille indledende udvækst (en knop), der forstørres indtil den størrelse nærmer sig den som modercellen har og adskilles herefter fra modercellen. Nogle trådformede bakterier (visse Actinomycetes) reproducerer sig ved at producere kæder af konidiesporer (en ukønnet spore) på spidserne af deres trådfilamenter. Et par trådformede arter fragmenterer simpelthen og fragmenterne initierer væksten af nye celler.
5.6.2 Generationstid
For beregning af generationstid fro bakterier, vil vi kun se på reproduktion ved binære fission, som er langt den almindeligste form for reproduktion. Som det ses i tabel 5.6.2.1, deles en celle til to celler, to celler deles til fire celler og så videre. Når antallet af celler udtrykkes som en potens af 2, fortæller eksponenten antallet af fordoblinger (generationer) der er forekommet.
Den nødvendige tid for at en celle deler sig (og populationen fordobles), kaldes for generationstiden. Generationstiden varierer meget mellem de forskellige mikroorganismer og med miljøforholdene, for eksempel temperaturen. De fleste bakterier har en generationstid på mellem 1 og 3 timer, men nogle kræver mere end 24 timer per generation. Hvis binær fission fortsætter ukontrolleret, vil et enormt antal celler blive produceret. Hvis en fordobling af populationen fandt sted hver 20. minut – hvilket er tilfældet for E. coli under gunstige betingelser, ville der efter 20 generationer og en startende celle, være over 1 million celler. Dette ville kræve lidt mindre end 7 timer. Efter 30 generationer, eller 10 timer, ville populationen være nået cirka 1 milliard og i løbet af 24 timer, ville det være eksploderet til et tal med 21 nuller. Det er svært grafisk at afbilde populationsændringer med så store tal ved brug af aritmetiske tal. Derfor benyttes logaritmisk skala generelt til grafisk at repræsentere bakterievækst. Se tabel 5.6.2.2. Forståelsen af logaritmisk repræsentation af bakterielle populationer, kræver brug af matematik og er en nødvendighed for alle der ønsker at studere mikrobiologi.
5.6.3 Logaritmisk fremstilling af bakteriepopulationer
For at illustrere forskellen mellem logaritmisk og aritmetisk graftegning af bakterielle populationer, så lad os bruge de 20 bakterielle generationer der er i tabel 5.6.2.2, hvor der er angivet både det aritmetiske tal og det tilsvarende logaritmiske tal. Ved fem generationer (25) ville der være 32 celler, ved ti generationer (210), ville der være 1.024 celler og så videre.
I figur 5.6.3.1, vil man bemærke at den aritmetisk tegnede linje (den ikke brudte) ikke klart, viser populationens ændring. Faktisk synes de ti første generationer, slet ikke at forlade bundlinjen. På den logaritmiske graf (den stiplede linje) er punktet for tiende generation (3,01) halvvejs oppe ad grafen. Endvidere ville yderligere en eller to generationer afbilledet aritmetisk i samme målestok, føre grafen helt ud af papiret.
Den stiplede linje i figur 5.6.3.1 viser, hvordan disse indtegningsproblemer kan undgås ved brug af Log10 funktionen ved graftegning af populationstal. Log10 af populationstallet er indtegnet ved 5., 10., 15. og 20. generation. Bemærk at linjen bliver en ret linje og at tusinde gange dette populationstal (1.000.000.000 eller Log10 = 9.0) let ville kunne indpasses i grafen ved at udvide den blot en smule. Denne fordel opnås, ved at forvrænge vores ”sunde fornufts” opfattelse af den reelle situation. Vi er ikke vant til at tænke i logaritmiske relationer, men det er nødvendigt for en korrekt forståelse af grafer til afbildning af mikrobielle populationer.
5.6.4 Vækstfaser
Når få bakterier podes i et flydende vækstmedium og populationen tælles i intervaller, der det muligt at tegne en bakterievækstgraf, der viser væksten af celler, som en funktion af tiden. Se figur 5.6.4.1. Der er fire grundlæggende faser af vækst: lagfasen, den eksponentielle fase, den stationære fase og dødsfasen.
Lagfasen
I et stykke tid, ændres antallet af celler sig meget lidt, fordi cellerne ikke straks reproducerer sig i et nyt dyrkningsmedie. Denne periode med ringe eller inden celledeling kaldes for lagfasen (eller latentfasen) og den kan vare i en time eller flere dage. I løbet af denne periode, er cellerne dog ikke hvilende. Den mikrobielle population, er inde i en periode med hektisk metabolisk aktivitet, der især involverer syntesen af enzymer og forskellige andre molekyler. Situationen kan sammenlignes med en bilfabrik. Når produktionen af biler skal påbegyndes, er der en heftig aktivitet med at klargøre de forskellige komponenter bilen består af, men ikke nogen stigning i antallet af færdige biler.
Den eksponentielle fase
Til sidst begynder cellerne at dele sig og kommer ind i en periode med eksponentiel vækst, som kaldes for den eksponentielle fase (eller den logaritmiske fase). Den cellulære reproduktion er mest aktiv i denne periode og generationstiden (intervallet hvorunder populationen fordobles) er mindst muligt men konstant. Da generationstiden er konstant, vil en graf tegnet over de logaritmiske værdier, være en ret linje. Den eksponentielle fase, er den fase hvor cellerne er mest aktive metabolisk, og er den fase der foretrækkes til industrielle formål, for eksempel effektiv produktion af et produkt.
Den stationære fase
Hvis den eksponentielle vækst forsatte uhindret, ville et forbløffende antal celler opstå. For eksempel kan en enkelt bakterie (der har en vægt på 9,5 · 10-13 g per celle), der deler sig hvert 20. minut, teoretisk kunne frembringe en population med samme vægt som et 80.000 tons tungt hangarskib, på kun 25,5 time. I virkeligheden sker dette dog ikke. Vækstraten aftager til sidst og antallet af celler der dør, afbalancerer antallet af nye celler og populationen stabiliseres. Denne periode i ligevægt kaldes for den stationære fase.
Hvad årsagen er til at den eksponentielle vækst stopper, er ikke altid klar. Forbrug af næringsstofferne, ophobning af affaldsstoffer og skadelige ændringer i pH kan alle spille en rolle.
Dødsfasen
Antallet af celler der dør overstiger i sidste ende antallet af nye celler der dannes og populationen går ind i dødsfasen (eller den logaritmiske tilbagegangsfase). Denne fase fortsætter, indtil populationen formindskes til en brøkdel af antallet i den stationære fase, eller indtil populationen uddør helt. Nogle arter passerer gennem hele serien af faser på kun et par dage og nogle arter bibeholder nogle få overlevende celler næsten uendeligt.
5.6.5 Direkte måling af bakterievækst
Væksten af bakterielle populationer, kan måles på en række måder. Nogle metoder måler celletal; andre metoder måler populationens samlede masse, som ofte er direkte proportional med celleantal. Populationstallet registreres sædvanligvis, som antallet af celler i en milliliter væske eller i et gram fast materiale. Fordi bakterielle populationer normalt er meget store, er de fleste metoder baseret på direkte eller indirekte tællinger af meget små prøver; beregninger bestemmer herefter størrelsen af den samlede population. Betragt for eksempel en milliontedel af en milliliter (10-6 mL) af syrnet mælk, der indeholder 70 bakterieceller. Det vil sige at der skal være 70 gange 1 million, eller 70 millioner, celler per milliliter mælk.
Det er imidlertid ikke praktisk at måle en milliontedel af en milliliter væske eller et milliontedel af et gram af en fødevare. Derfor, sker optællingen indirekte, gennem fortynding. For eksempel, hvis vi tilføjer 1 mL mælk til 99 mL vand, vil hver milliliter af denne opløsning nu have en hundrededel så mange bakterier som en milliliter af den oprindelige prøve havde. Ved at lave en sådan fortyndingsrække, kan vi let estimere antallet af bakterier i vores oprindelige prøve. For at tælle antal mikroorganismer i faste fødevarer (for eksempel en hamburger), fremstillet et homogenat af en del mad og 9 dele vand, som blendes. Prøver af denne første tiendedel fortynding kan derefter overføres med pipette for yderligere fortynding eller celletælling.
Pladetælling
Den hyppigst anvendte metode til måling af bakterielle populationer, er kimtal (eller pladetælling). En vigtig fordel ved denne fremgangsmåde er, at den måler antallet af levedygtige celler. En ulempe kan være, at det tager et stykke tid, almindeligvis 24 timer eller mere, før synlige kolonier dannes. Dette kan være et alvorligt problem ved nogle applikationer, for eksempel kvalitetskontrol af mælk, når det ikke er muligt at tilbageholde et parti varer i denne tidsperiode.
Pladetællinger antager, at hver levende bakterie vokser og deler dig, til frembringelse af en enkelt koloni. Dette er dog ikke altid tilfældet, fordi bakterier ofte vokser forbundet i kæder eller som klumper. Derfor resulterer en koloni ikke altid fra en enkelt bakterie, men fra korte segmenter af en kæde eller fra en bakteriel klump. For at afspejle denne virkelighed, er kimtal ofte rapporteret som kolonidannende enheder (KDE).
Når en kimtalstælling udføres, er det vigtigt, at kun et begrænset antal kolonier udvikler sig på pladen. Når alt for mange kolonier er til stede, er nogle områder overfyldte og nogle celler udvikler sig deraf ikke; dette vil give en unøjagtighed i optællingen. Internationale standarder beskriver, at man kun tæller plader med mellem 25 og 250 enkeltkolonier, men mange mikrobiologer foretrækker plader med 30 til 300 enkeltkolonier. For at sikre at nogle af pladerne vil være inden for disse intervaller, foretages der det, der kaldes en fortyndingsrække. Se figur 5.5.6.1.
Fortyndingsrækker
Lad os for eksempel sige, at en prøve mælk har 10.000 bakterier per milliliter. Hvis 1 mL af denne prøve blev spredt på en dyrkningsplade, ville der i teorien blive dannet 10.000 kolonier. Dette ville naturligvis ikke give en plade der kunne tælles. Hvis 1 mL af denne prøve blev overført til et rør med 9 mL sterilt vand, ville hver milliliter væske i dette rør nu indeholder 1.000 bakterier. Hvis 1 mL af denne opløsning, blev podet i en petriskål, ville der stadig være for mange potentielle kolonier til at pladen kunne tælles. Derfor kunne man fortsætte fortyndingsrækken et skridt yderligere. 1 mL indeholdende 1.000 bakterier, ville blive overført til et rør med 9 mL sterilt vand. Hver milliliter af dette rør vil nu kun indeholde 100 bakterier og hvis 1 mL af dette rør blev podet til en dyrkningsplade, ville der potentielt dannes 100 kolonier – et antal der er let at tælle.
Kochs pladespredning og pladespredning
En kimtalstælling kan udføres, enten ved Kochs pladespredning eller ved pladespredning. Kochs pladespredning, følger proceduren vist i figur 5.5.6.2 (a). Enten overføres 1,0 mL eller 0,1 mL af bakteriefortyndingen til en tom petriskål. Næringsmediet, der holdes flydende ved at opbevare det i et 50 ºC varmt vandbad, hældes over prøven, som herefter blandes med prøven ved forsigtig omrøring af pladen. Når agaren størkner inkuberes pladen. Med Kochs pladespredningsmetode, vil kolonier vokse i dyrkningspladen samt på overfladen af det.
Denne teknik har nogle ulemper, fordi nogle relativt varmefølsomme mikroorganismer kan blive beskadiget af den smeltede agar og vil derfor ikke være i stand til at danne kolonier. Samtidig vil, når der benyttes særlige differentielle medier, det karakteristiske udseende af en koloni gå tabt og dette udseende er essentielt for diagnostiske formål. For at undgå disse problemer, bruges i stedet pladespredningsmetoden i vidt omfang. Se figur 5.5.6.2 (b). Her tilsættes 0,1 mL podemateriale til en færdigstøbt dyrkningsplade, og spredes herefter ligeligt med for eksempel en drigalskispatel. Denne fremgangsmåde positionerer alle kolonierne på overfladen af dyrkningsmediet og forhindrer direkte kontakt mellem cellerne og den smeltede varme agar.
Filtrering
Når mængden af bakterier er meget lille, som for eksempel i søer eller rene vandløb, kan bakterier tælles ved filtreringsmetoden. Se figur 5.5.6.3. I denne metode ledes mindst 100 mL vand igennem et tyndt membranfilter, hvis porer er for små til at tillade bakterier at passere. Således filtreres bakterierne fra og tilbageholdes på overfladen af filteret. Dette filter overføres herefter til en petriskål indeholdende et dyrkningsmedie, hvor kolonier begynder at vokse frem på filterets overflade. Denne metode anvendes ofte til påvisning og tælling af coliforme bakterier, som er en indikator for fækal forurening af fødevarer eller vand. De dannede kolonier med disse bakterier, er karakteristiske hvis der anvendes et differentielt medium (de i figur 5.5.6.3 viste kolonier er eksempler på colibakterier).
Direkte mikroskopisk tælling
I metoden for direkte mikroskopisk tælling, er en afmålt mængde af en bakteriel suspension placeret inden for et afgrænset område på et objektglas. På grund af den tidligere nævnte overvejelse omkring tidsforbrug, anvendes denne metode ofte til at tælle bakterier i for eksempel mælk. En 0,01 mL spredes over en kvadratcentimeter på et særligt tællekammerobjektglas og et farvestof tilsættes så bakterierne ses tydeligt. Herefter betragtes prøven under et mikroskops olieimmersionsobjektiv. Tællekammeret er inddelt i mange mindre områder og når antallet af bakterier er talt i flere forskellige områder, kan det gennemsnitlige antal bakterier per område bestemmes. Ud fra disse data, kan antallet af bakterier i den kvadratcentimeter over hvilken prøven blev spredt også beregnes. Fordi dette område i tællekammeret indeholdt 0,01 mL prøve, kan antallet af bakterier per milliliter af suspensionen beregnes ved at gange resultatet med 100. Se figur 5.5.6.4.
Motile bakterier er vanskelige at tælle med denne metode og som det sker med andre mikroskopiske metoder, er det også lige så sandsynligt at døde celler tælles med som levende celler. Ud over disse ulemper, skal der være en høj koncentration af bakterier, før prøven bliver tællelig – omkring 10 millioner bakterier per milliliter. Den vigtigste fordel ved mikroskopisk tælling, er at metoden ikke kræver inkubationstid. Den er normalt også forbeholdt applikationer, hvor tiden der går fra prøven udtages til resultatet foreligger er en af de primære overvejelser. Denne fordel gælder også elektroniske celletællere, der automatisk tæller antallet af celler i et afmålt volumen. Disse instrumenter anvendes i nogle forskningslaboratorier og hospitaler.
5.6.6 Estimering af bakterieantal ved indirekte metoder
For nogle typer af eksperimentelt arbejde, er estimering ved hjælp af turbiditet en praktisk måde at overvåge bakterievækst på. Når bakterier formerer sig i et flydende dyrkningsmedie, bliver mediet grumset eller uklart med bakterieceller.
Instrumentet der anvendes til måling af turbiditet, er et spektrofotometer (eller colorimeter). I spektrofotometret, transmitteres en stråle af lys, gennem en bakteriel suspension til en lyssensitiv detektor. Se figur 5.6.6.1. Som bakterieantallet stiger, vil mindre lys nå detektoren. Denne ændring af mængden af lys, vil blive registreret på instrumentet som den procentdel af det transmitterede lys der ikke når detektoren (T%). Der er ofte også angivet logaritmiske tal på måleinstrumentet, der kaldes absorbansen (undertiden også kaldt optisk densitet eller OD). Absorbansen, bruges til at afbilde bakterievæksten grafisk. Når bakterierne er i den eksponentielle fase eller i dødsfasen, vil en graf over absorbansen henover tiden, være en omtrentlig lige linje. Hvis absorbansaflæsningen bliver sammenlignet med pladetællinger foretaget på samme tidspunkt af den samme kultur, kan denne korrelation bruges i fremtidige skøn over antallet af bakterier til stede ved et givent måleresultat af turbiditeten.
Mere end en million bakterieceller per milliliter skal være til stede før de første spor af turbiditet vil være synlige. Det er nødvendigt med omkring 10 millioner til 100 millioner bakterieceller per milliliter, for at gøre en suspension uklar nok til at den kan aflæses med et spektrofotometer. Derfor er turbiditet ikke et brugbart redskab, ved mål af forureningen af væsker med et relativt lille antal bakterier.
Metabolisk aktivitet
En anden indirekte måde at vurdere antallet af bakterier på, er ved at måle en populations metaboliske aktivitet. Denne metode forudsætter, at mængden af et bestemt metabolisk produkt, så som for eksempel syre eller kuldioxid, er direkte proportional med antallet af tilstedeværende bakterier. En eksempel på en praktisk anvendelse af en metabolisk test, er det tidligere omtalte mikrobiologiske test, hvori syreproduktionen anvendes til at bestemme mængden af et vitamin.
Tørvægt
For trådformede bakterier og skimmelsvampe, er de sædvanlige målemetoder mindre tilfredsstillende. En kimtalstælling ville ikke kunne måle en stigning i trådformede bakteriers masse. Ved pladetælling af actinomycetes og skimmelsvampe, er det for det meste antallet af ukønnede sporer der tælles i stedet. Dette er ikke et godt mål for vækst. En bedre måde at måle væksten af filementøse organismer er tørvægt. I denne procedure, er svampen fjernet fra dyrkningsmediet, filtreret for at fjerne uvedkommende stoffer og tørret i et tørreapparat. Herefter vejes det. For bakterier er fremgangsmåden grundlæggende den samme.