6.3 – Ændringer i det genetisk materiale

En celles DNA kan ændres ved mutationer og horisontal genoverførsel. Ændringer i DNA resulterer i genetiske variationer, der kan påvirke den mikrobielle funktion (for eksempel biofilmdannelse, patogenicitet og antibiotikaresistens). Overlevelse og reproduktion af bakterier med en ny genotype, kan blive begunstiget af naturlige og menneskeskabte påvirkninger af miljøet og resultere i en enorm mangfoldighed af mikroorganismer. Overlevelsen af nye genotyper, kaldes naturlig udvælgelse.

6.3.1 Mutation

En mutation er en permanent ændring i basesekvensen af DNA. En sådan ændring, vil undertiden forårsage en ændring af produktet det ændrede gen koder for. For eksempel, når genet for et enzym muterer, kan enzymet som genet koder for blive inaktivt eller mindre aktivt, fordi dets aminosyresekvens er ændret. En sådan ændring i genotype, kan være uhensigtsmæssig eller endog dødelig, hvis cellen mister et fænotypisk træk den behøver. Dog kan en mutation også være fordelagtig, hvis for eksempel det ændrede enzym har en ny eller forbedret aktivitet, der gavner cellen.

6.3.2 Typer af mutationer

Mange simple mutationer er neutrale; ændringen i DNA basesekvensen forårsager ingen ændring i aktiviteten for produktet genet koder for. Neutrale mutationer opstår normalt, når en nukleotid bliver byttet med en anden i DNA, specielt på et sted der korresponderer med den tredje position af mRNA codonen. På grund af degenereringen af den genetiske kode, vil den resulterende codon måske stadig kode for den samme aminosyre. Selvom aminosyren ændres, kan funktionen af proteinet ikke ændre sig, hvis aminosyren er i en ikke-vital del af proteinet, eller er kemisk meget lig den oprindelige aminosyre.

Den mest almindelige type af mutation, involverer enkelte basepar og kaldes basesubstitution (eller punktmutation), i hvilken en enkelt base på et punkt i DNA sekvensen er blevet erstattet med en anden base. Når DNA replikeres, er resultatet et substitueret basepar. Se figur 6.3.2.1. Hvis der opstår en basesubstitution i et gen der koder for et protein, vil mRNA transskriberet fra genet bære en forkert base ved denne position. Når mRNA translateres til et protein, kan den ukorrekte base, forårsage indsættelse af en forkert aminosyre i proteinet, Hvis basesubstitution resulterer i en aminosyresubstitution i det syntetiserede protein, er denne ændring i DNA kendt som fejllæst mutation. Se figur 6.3.2.2 a og b.

Figur 6.3.2.1 – Basesubstitution

Virkningerne af sådanne mutationer kan være dramatiske. For eksempel skyldes seglcellesygdom, en enkelt ændring i genet for globin, der er proteinkomponenten i hæmoglobin. Hæmoglobin er primært ansvarlig for transport af ilt fra lungerne til vævene. En enkelt ændring fra et A til et T på et specifikt sted resulterer i en ændring fra glutaminsyre til valin i proteinet. Dette bevirker, at formen på hæmoglobinmolekylet ændres under betingelser med lavt oxygenindhold, der medfører ændring af formen på de røde blodlegemer. Misdannede røde blodlegemer bevæger sig ikke så godt gennem kapillærerne og kan begrænse blodgennemstrømningen og dermed forårsage organskader.

Ved at oprette en nonsens (stop) codon i midten af en mRNA molekyle, kan nogle basesubstitutioner effektivt forhindre syntese af et komplet funktionelt protein; kun et fragment af proteinet syntetiseres. En basesubstitution der resulterer i en nonsens codon, kaldes en nonsens mutation. Se figur 6.3.2.2 c.

Ud over basepar-mutationer, er der også ændringer i DNA kaldet rammeskiftmutationer (eller læserammeforskydningsmutationer), hor en eller nogle få nukleotidpar slettes eller indsættes i DNA’et. Se figur 6.3.2.2 d. Denne mutation kan forskyde ”den translationelle læseramme” – det er tre og tre grupperingen af nukleotider der kendes som codoner af tRNA’et under translation. For eksempel, forårsager sletningen af et nukleotidpar i midten af et gen, ændringer i mange aminosyrer efterfølgende, fra stedet for den oprindelige mutation. Rammeskiftmutationer resulterer næsten altid i en lang række af ændrede aminosyrer og produktion af et inaktivt protein fra det muterede gen. I di fleste tilfælde vil en nonsens codon opstå, og derved afslutte yderligere translation.

Figur 6.3.2.2 – Typer af mutationer og deres effekt på aminosyresekvensen i proteiner

Nogle gange forekommer mutationer, hvor et betydeligt antal baser indsættes i et gen. Huntingtons sygdom, er for eksempel en progressiv neurologisk lidelse forårsaget af ekstra baser indsat i et bestemt gen.

Basesubstitution og rammeskiftmutationer kan opstå spontant på grund af lejlighedsvise fejl, begået under DNA replikering. Disse spontane mutationer forekommer tilsyneladende i mangel på mutationsforårsagende agenser.

6.3.3 Mutagener

Kemiske mutagener
Agenser i miljøet, som for eksempel visse kemikalier og stråling, der direkte eller indirekte, kan medføre mutationer, kaldes for mutagener. I den mikrobielle verden, kan visse mutationer føre til for eksempel resistens over for antibiotika.

Et af de mange kemikalier der vides at være mutagene er salpetersyrling. Figur 6.3.3.1 viser hvordan udsættelse af DNS for salpetersyrling, kan konvertere basen adenin til en form, der danner par med cytosin i stedet for den sædvanlige thymin. Når DNA indeholdende sådanne modificeret adeninreplikater, vil et datter DNA molekyle have en baseparsekvens, der er forskellig fra forældre DNA’et. Til sidst vil nogle af AT baseparrene fra forældre DNA’et, være blevet ændret til GC basepar i barnebarn DNA’et. Salpetersyrling laver en specifik baseparændring i DNA. Som alle mutagener, ændrer det DNA på tilfældige steder.

Figur 6.3.3.1 – Oxidation af nukleotider danner et mutagen

En anden type af kemiske mutagener, er nukleosidanaloger. Disse molekyler ligner strukturelt den normale nitrogenholdige base, men de har nogle lidt ændret baseparringsegenskaber. Eksemplerne 2-aminopurin og 5-bromuracil, er vist i figur 6.3.3.2. Når nukleosidanaloger gives til voksende celler, bliver analogerne tilfældigt inkorporeret i det cellulære DNA i stedet for de normale baser. Derefter, under DNA replikering, forårsager analogerne fejl i baseparringen. De ukorrekt parrede baser vil blive kopieret under efterfølgende replikering af DNA, hvilket resulterer i baseparsubstitution i datter celler. Nogle antivirale og antitumorlægemidler er nukleosidanaloger, herunder AZT (azidothymidin), et af de primære lægemidler, der anvendes til behandling af HIV.

Figur 6.3.3.2 – Nukleosidanaloger og nitrogenholdige baser de erstatter

Endnu andre kemiske mutagener forårsager små sletninger eller indsættelser, hvilket kan resultere i rammeskiftmutationer. For eksempel er benzopyren, der er tilstede i røg og sod, under visse betingelser et effektivt rammeskiftmutagen. Aflatoxin – produceret af Aspergillus flavis, en skimmel der vokser på jordnødder og korn – et rammeskiftmutagen, ligesom de acridinfarvestoffer der eksperimentelt har været anvendt mod herpesvirusinfektioner. Rammeskiftmutagener har normalt den rigtige størrelse og kemiske egenskaber, til at kunne glide igennem de samlede basepar i DNA dobbeltspiralen. De kan virke ved at ophæve lidt af de to strenge DNA, hvilket efterlader et hul eller en bule i den ene streng. Når DNA strengene kopieres under DNA syntese, kan et eller flere basepar indsættes eller slettes i den nye dobbeltstrengede DNA. Rammeskiftmutagener er ofte kraftige carcinogene stoffer.

Stråling
Røntgen- og gammastråler er former for stråling der er potente mutagener, på grund af deres evne til at ionisere atomer og molekyler. De gennemtrængende stråler af ioniserende stråling er årsag til at elektronerne hopper ud af deres sædvanlige baner (elektronskaller). Disse elektroner, bombarderer andre molekyler og forårsager yderligere skade og mange af de resulterende ioner og frie radikaler (molekylære fragmenter med uparrede elektroner) er meget reaktive. Nogle af disse ioner kan oxidere baser i DNA, hvilket resulterer i fejl i DNA replikeringen og reparationen, hvilket igen producerer mutationer. Se figur 6.3.3.1. Et endnu mere alvorligt resultat, er brud på kovalente bindinger i sukker-phosphat-rygraden i DNA, der forårsager fysiske huller i kromosomerne.

En anden form for mutagen stråling er ultraviolet (UV) lys, der er en ioniserende bestanddel af almindeligt sollys. Imidlertid bliver det mest mutagene komponent i ultraviolet lys (bølgelængde 260 nm) sorteret fra i Jordens ozonlag. Den vigtigste virkning af direkte UV lys på DNA, er dannelsen af skadelige kovalente bindinger mellem pyrimidinbaser. De tilstødende thyminbaser i en DNA streng, kan krydslinke og danne thymin-dimere. Sådanne dimere, med mindre de repareres, kan forårsage alvorlige skader eller betyde døden for cellen, fordi den ikke længere kan omskrive eller kopiere DNA ordentligt.

Bakterier og andre organismer har enzymer, der kan reparere UV-induceret skade. Fotolyase, også kendt som lys-reparationsenzymer, bruger synlig lysenergi til at skille dimeren ad, til de to oprindelige thyminer. Nukleotid udskillelsesreparation, der er vist i figur 6.3.3.3, er ikke begrænset til UV-induceret skade; det kan reparere mutationer opstået på baggrund af andre årsager også. Enzymer skærer de forkerte baser bort og erstatter hullet med nysyntetiseret DNA, som er komplementær til den rigtige streng. I mange år satte biologer spørgsmålstegn ved hvordan den forkerte base kunne skelnes fra den rigtige, hvis det ikke var fysisk fordrejet som en thymin-dimer. I 1970 gav Hamilton Smith svaret med opdagelsen af methylaser. Disse enzymer tilføjer en methylgruppe til udvalgte baser, hurtigt efter en DNA streng er dannet. En reparations-endonuklease skærer kun i den ikke-methylerede streng.

Figur 6.3.3.3 – Dannelse og reparation af en thymin-dimer forårsaget af ultraviolet lys

Udsættelse for UV-lys hos mennesker, som for eksempel ved overdreven solbadning, forårsager et stort antal thymin-dimere i hudcellerne. Ikke-reparerede dimere, kan resultere i hudkræft. Mennesker med xeroderma pigmentosum, der er en nedarvet tilstand der resulterer i øget følsomhed over for UV-lys, har en defekt i nukleotid udskillelsesreparationen hvorfor de har øget risiko for hudkræft.

6.3.4 Hyppigheden af mutationer

Mutationsraten er sandsynligheden for at et gen muterer når en celle deler sig. Raten er normalt angivet som en potens af 10 og fordi mutationer er meget sjældne, er eksponenten altid et negativt tal. For eksempel, hvis der er en chance på en til en million for at et gen muterer når cellen deles, er raten 1/1.000.000, der udtrykkes som 10-6. Spontane fejl i DNA replikeringen finder sted med en meget lav rate, måske kun en gang for hver 109 replikerede basepar (en mutationsrate på en til en milliard). Fordi det gennemsnitlige gen har omkring 103 basepar, er den spontane rate for mutationer omkring et per 106 (million) replikerede gener.

Mutationer opstår normalt mere eller mindre tilfældigt langs et kromosom. Forekomsten af tilfældige mutationer ved lave hyppigheder, er et afgørende aspekt af tilpasningen for arter til deres omgivelser, for evolutionen kræver, at den genetiske mangfoldighed genereres tilfældigt og ved lav hyppighed. For eksempel i en bakteriel population af en betydelig størrelse – lad os sige 107 celler – vil der altid blive produceret et par mutantceller i hver generation. De fleste mutationer er enten skadelige og vil sandsynligvis blive fjernet fra genpuljen når den enkelte celle dør, eller er neutrale. Dog kan nogle få mutationer være gavnlige. For eksempel kan en mutation, der bibringer antibiotisk resistens være til gavn for en population af bakterier, der regelmæssigt udsættes for antibiotika. Når en sådan egenskab er opstået gennem mutation, vil celler der bærer det muterede gen, være mere tilbøjelige til at overleve og reproducere sig så længe miljøet forbliver det samme, end celler der ikke har mutationen. Snart vil de fleste celler i populationen have genet og en evolutionær ændring er sket, selv om det er i en lille målestok.

Et mutagen, øger normalt raten på spontan mutation, der er omkring en til 106 replikerede gener, med en faktor 10 til 1.000. Med andre ord, med tilstedeværelsen af et mutagen, vil den normale mutationsrate på 10-6 per replikeret gen, øges til en rate på 10-5 til 10-3 per replikeret gen. Mutagener anvendes eksperimentelt, til at øge produktionen af mutantceller, til forskning i genetiske egenskaber for mikroorganismer og til kommercielle formål.

6.3.5 Identifikation af mutanter

Mutanter kan detekteres ved at vælge eller teste for en ændret fænotype. Hvorvidt der anvendes et mutagen eller ej, er mutantceller med specifikke mutationer altid sjældne i forhold til andre celler i populationen. Problemet ligger i at detektere en sådan sjælden begivenhed.

Eksperimeter udføres normalt med bakterier, fordi de reproducerer sig hurtigt, så store populationer af organismer (mere end 109 per milliliter næringsmedie) kan anvendes. På grund af at bakterier normalt kun har en kopi af hvert gen per celle, kan virkningen af et mutagen ikke maskeres ved tilstedeværelsen af en normal version af genet, som for eksempel er tilfældet med mange eukaryote organismer.

Positiv (direkte) selektion, involverer påvisning af mutantceller ved afvisning af de ikke-muterede forældreceller. Lad os for eksempel antage, at vi forsøgte at finde mutantbakterier, der er resistente over for penicillin. Når de bakterielle celler udplades på et næringsmedium indeholdende penicillin, kan mutantcellerne identificeres direkte. De få celler i populationen, der er resistente (mutanterne) vil vokse og danne kolonier, mens de normale, penicillin-følsomme forældreceller ikke kan vokse.

For at identificere mutationer i andre former for gener, kan negativ (indirekte) selektion anvendes. Denne proces, udvælger en celle, der ikke kan udføre en bestemt funktion, under anvendelse af teknikken pladereplikering. Lad os for eksempel sige, at vi ønskede at bruge pladereplikering til at identificere en bakterie, som har mistet evnen til at syntetisere aminosyren histidin. Se figur 6.3.5.1. Først podes omkring 100 bakterier på en agarplade. Denne plade kaldes masterpladen og indeholder et næringsmedie der indeholder histidin, hvor alle bakterieceller vil vokse. Efter 18 til 24 timers inkubation, vil hver podet bakteriecelle have dannet en koloni. Herefter presses en steril pude, lavet af for eksempel latex, filterpapir eller fløjl, ned over masterpladen så nogle af cellerne fra hver koloni klæber til puden. Dernæst presses puden ned på to (eller flere) sterile plader. En plade indeholder et næringsmedie uden histidin og en indeholder et næringsmedie med histidin, som de oprindelige ikke-mutante bakterier kan vokse på. Enhver koloni der voksede på næringsmediet med histidin på masterpladen, men som ikke kan syntetisere histidin, vil ikke være i stand til at grå på næringsmediet uden histidin. Mutantkolonien kan herefter identificeres på masterpladen. Fordi mutanter selvfølgelig er meget sjældne (selv dem der er induceret med mutagener), skal der screenes mange plader med denne teknik, til isolering af en specifik mutant.

Figur 6.3.5.1 – Pladereplikeringsteknikken

Pladereplikering er en meget effektiv teknik til at isolere mutanter, der kræver en eller flere nye vækstfaktorer. Enhver mutant mikroorganisme, der har et ernæringsmæssigt krav der er fraværende i forældrecellen, er kendt som en auxotrof. For eksempel kan en auxotrof mangle et enzym, der er nødvendigt for at syntetisere en bestemt aminosyre og vil derfor kræve denne aminosyre som vækstfaktor i dets næringsmedie.

6.3.6 Identifikation af kemiske carcinogener

Mange kendte mutagener, har vist sig også at være carcinogene (kræftfremkaldende) stoffer, der kan forårsage kræft hos dyr, herunder mennesker. I de senere år, har kemikalier i miljøet, på arbejdspladsen og i kosten, været inddraget som årsager til kræft hos mennesker. Dyreforsøg er tidskrævende og dyre, så nogle hurtigere og billigere procedurer, til en foreløbig screening af potentielle carcinogener hvor der ikke bruges dyr, er blevet udviklet. En af disse, kaldet Ames-testen, anvender bakterier som carcinogene indikatorer.

Ames-testen er baseret på den iagttagelse, at eksponering af mutante bakterier, for mutagene stoffer kan forårsage nye mutationer, der tilbagefører virkningen (ændringen i fænotypen) af den oprindelige mutation. Disse kaldes reversioner. Specifikt, måler testen reversion af histidin auxotrofer af Salmonella (såkaldte his2 celler, der er mutanter som har mistet evnen til at syntetisere histidin) til histidin-syntetiserende celler (his1) efter behandling med et mutagen. Se figur 6.3.6.1. Bakterier inkuberes i både nærvær og fravær af stoffet der testes. Fordi animalske enzymer skal aktivere mange kemikalier til former, der er kemisk reaktive for at den mutagene eller carcinogene aktivitet kan vises, inkuberes mutantbakterierne sammen med rotteleverekstrakt, der er en rig kilde til aktiveringsenzymer. Hvis stoffet der bliver testet er mutagent, vil det medføre, at reversion af his2 bakterier til his1 bakterier, sker med en højere hastighed end den spontane mutationsrate. Antallet af observerede revertanter angiver i hvilken grad et stof er mutagent og derfor muligvis carcinogent.

Figur 6.3.6.1 – Ames-testen (Ames reverse gene mutation test)

Testen kan anvendes på mange måder. Flere potentielle mutagener kan kvalitativt ved at dryppe enkelte kemikalier på små papirdiske på en enkelt plade podet med bakterier. Ames-testen anvendes rutinemæssigt, til at vurdere nye kemikalier og luft- og vandforurenende stoffer.

Omkring 90% af stofferne, der ved Ames-testen findes mutagene, har også vist sig at være carcinogene hos dyr. Af samme årsag, er det generelt blevet fundet at mere mutagene stoffer også lader til at være mere carcinogene.

6.4 – Genetisk overførsel og rekombinering →