Genetisk rekombinering, refererer til udveksling af gener mellem to DNA molekyler, til dannelse af nye kombinationer af gener på et kromosom. Figur 6.4.1 viser en mekanisme til genetisk rekombinering. Hvis en celle opfanger fremmed DNA (kaldet donor DNA i figuren), kan noget af det indsættes i cellens kromosom – en proces kaldet overkrydsning – og nogle af de gener båret af kromosomerne blandes. DNA’et er rekombineret, således at kromosomet nu bærer en del af donorens DNA.

Hvis A og B repræsenterer DNA fra forskellige individer, hvordan bringes de så tæt nok sammen, til at kunne rekombinere? I eukaryoter, er genetisk rekombinering en ordnet proces, der normalt opstår som en del af den seksuelle cyklus af organismen. Overkrydsningen finder normalt sted under dannelsen af kønsceller, således at disse celler indeholder rekombineret DNA. I bakterier kan genetisk rekombinering ske på en række måder, som vi vil se på i de næste afsnit.
Ligesom mutation, bidrager genetisk rekombinering til en populations genetiske mangfoldighed, som er kilden i variationen i evolutionen. I højt udviklede organismer, som for eksempel nutidens mikroorganismer, er rekombinering mere tilbøjelig til at være gavnlig, end mutation er det, fordi rekombinering med mindre sandsynlighed vil ødelægge et gens funktion og kan samle kombinationer af gener, der sætter cellen i stand til at udføre en værdifuld ny funktion.
De største protein, der udgør flagellerne hos Salmonella er også et af de primære proteiner der forårsager at vores immunforsvar reagerer. Disse bakterier har evnen til at producere to forskellige flagelproteiner. Som vores immunforsvar igangsætter en reaktion mod de celler, der indeholder en form for flagellært protein, vil de organismer der producerer den anden form, være upåvirkede. Hvilket flagellært protein der produceres, bestemmes ved en rekombineringsbegivenhed, der tilsyneladende forekommer noget tilfældigt inden for det kromosomale DNA. Så ved at ændre flagellært protein, kan Salmonella bedre undgå værtens forsvar.
Vertikal genoverførsel opstår, når gener overføres fra en organisme til dens afkom. Planter og dyr overfører deres gener ved vertikal genoverførsel. Bakterier overfører ikke kun deres gener til deres afkom, men også lateralt til andre mikroorganismer af samme generation. Dette er kendt som horisontal genoverførsel. Se figur 6.1.3.1. Horisontal genoverførsel mellem bakterier forekommet på flere forskellige måder. I alle de mekanismer, involverer overførslen en donorcelle, som giver en del af sin totale DNA til en modtagercelle. Når overført, inkorporeres en del af donorens DNA normalt i modtagerens DNA; resten nedbrydes af cellulære enzymer. Modtagercellen der inkorporerer donor-DNA i sin egen DNA, kaldes en rekombinant. Overførsel af genetisk materiale mellem bakterier, er på ingen måde en hyppig begivenhed; det forekommer kun i 1% eller mindre af en hel population. Lad os i detaljer, se på de forskellige typer af genetisk overførsel.
6.4.1 Transformation i bakterier
Under processen transformation, overføres gener far en bakterie til en anden som ”nøgent” DNA i opløsning. Denne proces blev først påvist for over 70 år siden, selv om processen ikke blev forstået på det tidspunkt. Transformation viste ikke kun at genetisk materiale kunne overføres fra en bakteriecelle til en anden, men studiet af dette fænomen førte i sidste ende til den konklusion, af DNA er det genetiske materiale. Det indledende forsøg med transformation, blev udført af Frederick Griffith i England i 1928, mens han arbejdede med to stammer af Streptococcus pneumoniae. Den ene var en virulent stamme, som har en polysaccharidkapsel der forhindrer fagocytose. Bakterierne vokser og forårsager lungebetændelse. Den anden var en ikke-virulent stamme der mangler denne kapsel og ikke forårsager sygdom.
Griffith var interesseret i at bestemme, om injektioner af varmedræbte bakterier af den indkapslede stamme, kunne bruges til at vaccinere mus mod lungebetændelse. Som han forventede, dræbte injektioner med levende indkapslede bakterier musen (figur 6.4.1.1a); injektioner med levende ikke-indkapslede bakterier (figur 6.4.1.1b) eller døde indkapslede bakterier (figur 6.4.1.1c), dræbte ikke musen. Men når de døde indkapslede bakterier blev blandet med levende ikke-indkapslede bakterier og injiceret i musene, døde mange af musene. Arveligt materiale (gener) fra de døde bakterier, var gået over i de levende celler og havde ændret dem genetisk, så deres afkom blev indkapslede og dermed virulente (figur 6.4.1.1c).
Efterfølgende undersøgelser, baseret på Griffiths forskning viste, at bakteriel transformation kan udføres uden mus. En bouillon blev injiceret med levende ikke-indkapslede bakterier. Døde indkapslede bakterier blev herefter tilsat til bouillonen. Efter inkubation, blev kulturen fundet indeholdende levende bakterier, der blev indkapslede og virulente. De ikke-indkapslede bakterier var blevet transformeret; de havde erhvervet en ny arvelig egenskab ved at inkorporere gener fra de dræbte indkapslede bakterier.
Siden Griffiths eksperiment, er der opsamlet betydelig information om transformation. I naturen, frigiver nogle bakterier, måske efter de er døde eller bliver udsat for cellelyse, deres DNA til omgivelserne. Andre bakterier, kan herefter støde på DNA’et og, afhængig af de særlige arter og vækstbetingelserne, optage fragmenter af DNA’et og integrere det i deres egne kromosomer ved rekombinering. Et protein kaldet RecA.

Det næste skridt var at udtrække forskellige kemiske komponenter fra de dræbte celler, for at bestemme hvilket komponent der forårsagede transformationen. Disse afgørende eksperimenter blev udført i USA af Oswald T. Avery og hans medarbejdere Colin M. MacLeod og Maclyn McCarty. Efter mange års forskning, annoncerede de i 1944, at komponenten der var ansvarlig for at transformere uskadelige S. pneumoniae til virulente stammer, var DNA. Deres resultater leverede en af de afgørende indikationer på, at DNA faktisk var bærer af genetisk information.
Siden Griffiths eksperiment, er der opsamlet betydelig information om transformation. I naturen, frigiver nogle bakterier, måske efter de er døde eller har være udsat for cellelyse, deres DNA til omgivelserne. Andre bakterier, kan herefter støde på DNA’et og, afhængig af de specifikke arter og vækstbetingelserne, optage nogle fragmenter af DNA og inkorporere dem i deres egne kromosomer ved rekombinering. Et protein kaldet RecA binder sig til cellens DNA og derefter til donor-DNA’et, der forårsager en udveksling af DNA strenge. En modtagercelle med denne nye kombination af gener, er en slags hybrid eller en rekombineret celle. Se figur 6.4.1.2. Alle efterkommere af en sådan rekombineret celle vil være identiske med denne. Transformation forekommer naturligt blandt meget få slægter af bakterier, herunder Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Acinobacter og visse stammer af slægterne Streptococcus og Staphylococcus.

Selvom kun en lille del af en celles DNA, overføres til modtageren, er de molekyler der skal passere gennem modtagerens cellevæg, stadig meget store. Når en modtagercelle er i en fysiologisk tilstand, hvor den kan optage donor-DNA, siges den at være kompetent. Med kompetence, følger ændringer i cellevæggen, som gør den gennemtrængelig for store DNA-molekyler.
6.4.2 Konjugation i bakterier
En anden mekanisme, hvorved genetisk materiale kan overføres fra en bakterie til en anden, er kendt som konjugation. Konjugation formidles af et slags plasmid, et cirkulært stykke DNA, der kopieres uafhængigt af cellens kromosom. Plasmider afviger fra bakterielle kromosomer, ved at generne de bærer, normalt ikke er afgørende for vækst af cellen under normale forhold. Plasmiderne der er ansvarlige for konjugation kan overføres mellem cellerne under konjugering.
Konjugation adskiller sig fra transformation på to vigtige måder. For det første, kræver konjugation direkte celle-til-celle kontakt. For det andet, skal de konjugerende celler generelt være af modsat parringstype; donorceller skal bære plasmidet og modtagercellerne skal normalt ikke bære det. I Gramnegative bakterier, bærer plasmidet gener, der koder for syntese af sex pili, udspring fra donorens celleoverflade der skaber kontakt til modtagercellen og hjælper med at bringe de to celler i direkte kontakt. Se figur 6.4.2.1a. Grampositive bakterier producerer klæbrige overflademolekyler, der forårsager at cellerne kommer i direkte kontakt med hinanden. I processen med konjugation, bliver plasmidet replikeret under overførslen af en enkeltstrenget kopi af plasmid-DNA’et til modtagercellen, hvor den komplementære streng syntetiseres efterfølgende. Se figur 6.4.2.1b.

Fordi det meste eksperimentelle arbejde med konjugation, er blevet foretaget med E. coli, vil beskrivelsen af processen for denne organisme bruges. I E. coli var F faktoren (fertilitetsfaktoren) det første plasmid der blev observeret overført mellem organismer ved konjugation. Donorer bærende F faktorer (F+ celler), overfører plasmidet til modtagercellen (F– celler), som dermed bliver F+ celler som resultat af denne overførsel. Se figur 6.4.2.2a. I nogle celler, der bærer F faktorer, integreres F faktoren i kromosomet, og omdanner en F+ celle til en Hfr celle (høj frekvens af rekombination). Se figur 6.4.2.2b. Når konjugation forekommer mellem en Hfr celle og en F– celle, replikeres Hfr cellens kromosom (med dens integrerede F faktor) og en forældrestreng af kromosomet overføres til modtagercellen. Se figur 6.4.2.2c. Replikeringen af Hfr kromosomet, begynder i midten af den integrerede F faktor og en lille stykke af F faktoren, overfører de kromosomale gener til F– cellen. Normalt går kromosomet i stykker, inden overførslen er helt færdig. Når det er kommet over i modtagercellen, kan donor DNA’et rekombineres med modtagercellens DNA (donor DNA der ikke integreres bliver nedbrudt). Derfor kan en F– celle, ved konjugation med en Hfr celle, erhverve nye versioner af kromosomale gener (ligesom ved transformation). Men det er stadig en F– celle, fordi den ikke har modtaget en komplet F faktor under konjugeringen.

Konjugation, bruges til at kortlægge placeringen af gener på et bakterielt kromosom. Se figur 6.4.2.3. Generne for syntese af threonin (thr) og leucin (leu), ligger færst vedlæsning med uret fra 0. Deres placeringer blev bestemt ved konjugationseksperimenter. Antag for eksempel, at konjugation er tilladt i kun 1 minut mellem en Hfr stamme der er his+, pro+, thr+ og leu+ og en F– stamme der er his-, pro-, thr- og leu-. Hvis F- cellen har erhvervet evnen til at syntetisere threonin, så må genet for thr være placeret tidligt på kromosomet, mellem 0 og 1 minut. Hvis cellen så efter 2 minutter bliver både thr+ og leu+, vil rækkefølgen af generne så være thr, leu.

6.4.3 Transduktion i bakterier
En tredje mekanisme til genetisk overførsel mellem bakterier er transduktion. I denne proces, overføres bakteriel DNA fra en donorcelle til en modtagercelle, inde i en virus der inficerer bakterier, kaldet en bakteriofag eller en fag.
For at forstå hvordan transduktion fungerer, vil vi kigge på livscyklussen for en type transducerende fag for E. coli; denne fag udfører generaliseret transduktion. Se figur 6.4.2.4.
Under fagens reproduktion, bliver fag-DNA’et og proteiner syntetiseret af værtscellen. Imidlertid kan bakterielt DNA, plasmid DNA eller endda DNA fra et andet virus, pakkes i fagens proteinkappe.
Alle gener indeholdt i en bakterie inficeret af en generaliseret transdukcerende fag, har lige stor sandsynlighed for at blive pakket i en fags proteinkappe og blive overført. I en anden type transduktion, kaldet specialiseret transduktion, er det kun bestemte bakterielle gener der overføres. I en type specialiseret transduktion, koder fagen for visse toksiner produceret af deres bakterielle værter, for eksempel difteritoksin hos Corynebacterium diphtheriae, erythrogentoksin hos Staphylococcus pyogenes og shigatoksin hos E. coli O157:H7.

6.4.4 Plasmider og transposoner
Plasmider og transposoner er genetiske elementer, er mekanismer der giver yderligere muligheder for genetisk ændring. De forekommer i både prokaryote og i eukaryote organismer, men denne gennemgang fokuserer på deres rolle i genetiske ændringer i prokaryoter.
Plasmider
Hvis du husker fra tidligere, så er plasmider selvreplikerende, genholdige cirkulære stykker af DNA der er cirka 1-5% af størrelsen på det bakterielle kromosom. Se figur 6.4.4.1b. De findes hovedsageligt i bakterier, men også i nogle eukaryote organismer, som for eksempel Saccharomyces cerevisiae. F faktoren er et konjugerende plasmid, der bærer generne for sex pili og for overførsel af plasmidet til en anden celle. Selvom plasmider normalt kan undværes, kan gener båret af plasmider under visse omstændigheder, være afgørende for overlevelse og vækst af cellen. For eksempel koder dissimilationsplasmider for enzymer, der udløser katabolisme af visse usædvanlige sukkerarter og carbonhydrider. Nogle arter af Pseudomonas kan faktisk anvende så eksotiske stoffer som toluen, kamfer og kulbrinter af råolie, som deres primære kulstof- og energikilder, fordi de har kataboliske enzymer kodet på gener båret af plasmider. Så specialiserede egenskaber tillader overlevelse for disse mikroorganismer i meget forskelligartede og udfordrende miljøer. På grund af deres evne til at nedbryde og afgifte en række usædvanlige forbindelser, er der mange af dem der undersøges for mulig brug i oprensning af miljømæssigt affald.

Andre plasmider koder for proteiner, der forbedrer patogenicitet i en bakterie. Stammen af E. coli, der forårsager spædbørnsdiarre og rejsediarre, bærer plasmider der koder for produktion af toksiner og for bakteriel fastgørelse til tarmceller. Uden disse plasmider, er E. coli en harmløs bakterie, bosiddende i tyktarmen; med plasmiderne er den patogen. Andre plasmidkodede toksiner omfatter exfoliativtoksin fra Staphylococcus aureus, Clostridium tetani neurotoksinet og toksiner fra Bacillus anthracis. Endnu andre plasmider indeholder gener til syntese af bakteriociner, toksiske proteiner der dræber andre bakterier. Disse plasmider er blevet fundet i mange bakterieslægter og er nyttige markører til identifikation af visse bakterier i kliniske laboratorier.
Resistensfaktorer (R faktorer) er plasmider, der har betydelig medicinsk betydning. De blev først opdaget i Japan i slutningen af 1950’erne, efter flere dysenteriepidemier. I nogle af disse epidemier, var smitstoffet resistent over for det sædvanlige antibiotikum. Efter isolering, bed patogenet også fundet at være resistent over for en række andre antibiotika. Desuden viste andre normale bakterier fra patienterne (som for eksempel E. coli) sig også at være resistente. Forskere opdagede hurtigt, at disse bakterier opnåede resistens gennem spredning af gener, fra en organisme til en anden. De plasmider som formidlede denne overførsel, kaldes R faktorer.
R faktorer bærer gener, som giver deres værtscelle resistens mod antibiotika, tungmetaller eller cellulære toksiner. Mange R faktorer indeholder to grupper gener. Den ene gruppe kaldes resistenstransferfaktor (RTF) og omfatter gener for plasmidreplikering og –konjugation. Den anden gruppe, kaldet r-determinanten, har resistensgenerne; den koder for produktion af enzymer, der inaktiverer lægemidler eller toksiske stoffer. Se figur 6.4.4.1a. Forskellige R faktorer der er til stede i den samme celle, kan rekombinere sig og producere nye R faktorer ned nye kombinationer af gener i deres r-determinanter.
I nogle tilfælde, er akkumulationen af resistente gener i et enkelt plasmid, ganske bemærkelsesværdig. For eksempel, viser figur 6.4.4.1a et genetisk kort over resistensplasmidet R100. Båret på dette plasmid, er resistensgener mod sulfonamider, streptomycin, chloramphenicol og tetracyclin, samt gener for resistens over for kviksølv. Dette særlige plasmid, kan overføres mellem en række enteriske slægter, herunder Escherichia, Klebsiella og Salmonella.
Tilstedeværende R faktorer, er et meget alvorligt problem for behandling af infektionssygdomme med antibiotika. Den udbredte anvendelse af antibiotika i medicin og landbrug, har ført til den præferentielle overlevelse (selektion) af bakterier der har R faktorer, så populationer af resistente bakterier kan vokse sig større og større. Overførslen af resistens mellem bakterieceller i en population og selv mellem bakterier af forskellige slægter, bidrager også til problemet. Evnen til at reproducere sig seksuelt med medlemmer af sin egen art, kendetegner eukaryote arter. Dog kan en bakterieart, konjugere og overføre plasmider til andre arter. Neisseria kan have erhvervet sit penicillinase-producerende plasmid fra Streptococcus og Agrobacterium kan overføre plasmider til planteceller. Nonkonjugative plasmider, kan overføres fra en celle til en anden, ved at indsætte sig selv i et konjugerende plasmid, et kromosom eller ved transformation, når de frigives fra en død celle. Insertion gøres mulig ved en insertionssekvens, som vi vil se nærmere på senere.
Plasmider er et vigtigt redskab i genteknologien, som vil blive behandlet senere.
Transposoner
Transposoner, er små segmenter af DNA, der kan bevæge sig (blive ”transponeret”) fra en region af et DNA molekyle til en anden. Disse DNA-stykker er 700 til 40.000 basepar lange.
I 1950’erne, opdagede den amerikanske genetiker Babara McClintock transposoner i majs, men de forekommer i alle organismer og er blevet studeret mest grundigt i mikroorganismer. De kan bevæge sig fra et sted til et andet sted på samme kromosom eller til et andet kromosom eller et plasmid. Som du sikkert kan forestille dig, kan den hyppige flytning af transposoner skabe ravage inde i en celle. For eksempel, som transposoner flytter sig på kromosomer, kan de indsætte sig selv ind midt i gener og inaktivere dem. Heldigvis sker transpotionering relativt sjældent. Hyppigheden af transpotionering kan sammenlignes med den spontane mutations rate, der forekommer i bakterier, det vil sige omkring 10–5 til 10-7 gange per generation.
Alle transposoner indeholder oplysninger om deres egen transpositionering. Som vist i figur 6.4.4.2a, indeholder de simpleste transposoner, også kaldet indsættelsessekvenser (IS), kun et gen der koder for et enzym (transposase, som katalyserer opskæring og genlukning af DNA, der forekommer ved transpositionering), samt genkendelsessteder. Genkendelsessteder, er korte omvendte gentagelsessekvenser af DNA, dom enzymet genkender som rekombineringssteder mellem transposonet og kromosomet.

Komplekse transposoner, bærer også andre gener der ikke er forbundet med transpositioneringssprocessen. For eksempel, kan bakterielle transposoner indeholde gener for enterotoksin eller for antibiotikaresistens, se figur 6.4.4.2b. Plasmider, som for eksempel R faktorer, består ofte af en samling af transposoner, se figur 6.4.4.2c.
Transposoner med antibiotikaresistensgener er af praktisk interesse, men der er ingen begrænsning i de typer gener, transposoner kan have. Således giver transposoner en naturlig mekanisme, for bevægelse af gener fra et kromosom til et andet. Endvidere, fordi de kan transporteres mellem celler på plasmider eller via vira, kan de også spredes fra en organisme – eller endda arter – til en anden. For eksempel blev vancomycinresistens overført fra Enterococcus faecalis til Staphylococcus aureus gennem en transposon, kaldet Tn1546. Transposoner er således en potentiel magtfuld formidler af evolution i organismer.