Forskere og teknikere, isolerer bakterier og svampe fra naturlige miljøer, som for eksempel jord og vand, for at finde, eller udvælge, de organismer der producerer et ønsket produkt. Den udvalgte organisme kan være muteret til at fremstille mere af et produkt, eller til at fremstille et bedre produkt.
7.2.1 Udvælgelse
I naturen, vil organismer med karakteristika der forbedrer deres overlevelsesevne, have større tilbøjelighed til overlevelse og reproduktion, end varianter der mangler disse træk. Dette kaldes naturlig udvælgelse. Mennesker bruger kunstig udvælgelse til at vælge ønskelige træk hos racer af dyr og arter af planter. Som mikrobiologer lærte at isolere og dyrke mikroorganismer i renkulturer, blev de også i stand til at udvælge dem, der kunne udføre det ønskede mål, som for eksempel at gøre ølbrygning mere effektiv eller producere et nyt antibiotikum. Over 2.000 stammer af antibiotikaproducerende bakterier er blevet opdaget, ved at teste jordbakterier og udvælge de stammer der producerede et antibiotikum.
7.2.2 Mutation
Mutationer er ansvarlig for meget af livets mangfoldighed. En bakterie, med en mutation der giver resistens over for et antibiotikum, vil overleve og formere sig, selv i nærværet af dette antibiotikum. Biologer, der arbejdede med antibiotikaproducerende mikroorganismer, opdagede, at de kunne skabe nye stammer ved at udsætte mikroorganismer for mutagener. Efter tilfældige mutationer blev skabt i penicillinproducerende Penicillium ved at udsætte den for stråling, blev den højest ydende variant blandt de overlevende udvalgt til en anden eksponering for et mutagen. Ved hjælp af mutationer, lykkedes det biologerne at øge mængden af penicillin som svampen producerede, mere end 1.000 gange.
Screening af hver eneste mutant for produktion af penicillin er en kedelig proces. Steddirigeret mutagenese er mere målrettet og kan bruges til at lave en bestemt ændring i et gen. Hvis du forestiller dig, at du fandt ud af at ændring af en aminosyre ville få et vaskepulverenzym til at virke bedre i koldt vand. Ved at bruge den genetiske kode (se figur 6.1.5.1), kunne du ved at anvende de beskrevne teknikker, fremstille sekvensen af DNA, der koder for nævnte aminosyre og indsætte sekvensen i dette enzyms gen.
Videnskaben om molekylær genetik, har avanceret i en sådan grad, at mange rutinemæssige kloningsteknikker udføres ved hjælp af færdigpakkede kits og procedurer, der meget ligner opskrifterne i en kogebog. Forskerne har en bred vifte af metoder og vælge imellem, afhængig af den endelige anvendelse for deres eksperimenter.
7.2.3 Restriktionsenzymer
Rekombinerende DNA teknologi, har sine tekniske rødder i opdagelsen af restriktionsenzymer, en særlig klasse af DNA opskærende enzymer, der findes i mange bakterier. De blev første gang isoleret i 1970, men restriktionsenzymer var faktisk blevet observeret i naturen tidligere, når visse bakteriofager viste sig at have et begrænset værtsinterval. Når disse fager, blev anvendt til at inficere andre bakterier end deres sædvanlige værter, blev næsten alt fag DNA’et ødelagt i den nye vært af restriktionsenzymer. Restriktionsenzymerne beskytter en bakteriecelle, ved at hydrolysere fag DNA’et. Den bakterielle DNA er beskyttet mod nedbrydning, fordi cellen methylerer (tilføjer methylgrupper til) nogle af cytosinerne i sit DNA. De oprensede former af disse bakterielle enzymer anvendes i dagens laboratorier.
Hvad der er vigtigt for rDNA teknikkerne er, at et restriktionsenzym kun genkender og opskærer eller nedbryder en særlig sekvens af nekleotidbaser i DNA og at det opskærer denne sekvens op samme måde hver gang. Typisk anvendte restriktionsenzymer i kloningseksperimenter, kan genkende fire, seks, eller otte basesekvenser. Hundredevis af restriktionsenzymer er kendt, der hver producerer DNA fragmenter med karakteristiske ender. Nogle få restriktionsenzymer er anført i tabel 7.2.3.1. Man kan se at de er opkaldt efter deres bakterielle kilde. Nogle af disse enzymer (for eksempel HaeIII) opskærer begge strenge af DNA på samme sted og producerer stumpe ender og andre laver forskudte snit i de to DNA strenge, der ikke er direkte modsat af hinanden (se figur 7.2.3.1). Disse forskudte ender, eller klistrede/klæbrige ender, er de mest nyttige i rDNA, fordi de kan anvendes til at forbinde de to forskellige DNA stykker, der er blevet skåret af det samme restriktionsenzym. De klistrede ender ”klistrer” sig til strækninger af enkeltstrenget DNA ved komplementær baseparring.
Bemærk i figur 7.2.3.1, at de mørkere basesekvenser på de to strenge er ens, men kører i modsatte retninger. Forskudte opskæringer efterlader strækninger af enkeltstrenget DNA ved enderne af DNA fragmenterne. Hvis to fragmenter af DNA fra forskellige kilder er blevet fremstillet under indvirkning fra samme restriktionsenzym, vil de to fragmenter have et identisk sæt af klistrede ender og kan splejses sammen (rekombineres) in vitro. De klistrede ender kan splejses sammen spontant ved hydrogenbindinger (baseparing). Enzymet DNA ligase anvendes til kovalent at binde rygraden i DNA stykkerne sammen, til frembringelse af et rDNA molekyle.
7.2.4 Vektorer
Mange forskellige typer DNA molekyler, kan fungere som vektorer, forudsat at de har visse egenskaber. Den vigtigste egenskab er at de er selvreplikerende; når først de er i en celle, skal vektoren være i stand til at replikere sig selv. Alt DNS, der indsættes i vektoren, vil blive replikeret i denne proces. Således, tjener vektorer som bærere for replikering, af de ønskede DNS sekvenser.
Vektorer skal også være store nok, til at blive manipuleret uden for cellen under rDNA proceduren. Mindre vektorer manipuleres lettere end større DNA molekyler, der har en tendens til at være mere skrøbelige. Bevaring, er en anden vigtig egenskab for vektorer. DNA molekylets cirkulære form, beskytter vektor DNA’et fra at blive ødelagt af modtagercellen. Bemærk i figur 7.2.4.1, at DNA af et plasmid er cirkulært. En anden bevaringsmekanisme forekommer, når et virus DNA molekyle indsættes hurtigt i kromosomet hos værten.
Når det er nødvendigt at høste celler, der indeholder vektoren, hjælper et markørgen på vektoren ofte. Fælles selekterbare markørgener er for antibiotikaresistens eller for et enzym, der foretager en let identificerbar reaktion.
Plasmider er en af de primære vektorer i anvendelse, især varianter af R-faktor plasmider. Plasmid DNA kan skæres med de samme restriktionsenzymer som DNA’et, der skal klones, således at alle dele af DNA vil have de samme klistrede ender. Når stykkerne blandes, vil det DNA, der skal klones blive indsat i plasmidet (se figur 7.2.3.1). Bemærk, at andre fragmentkombinationer kan forekomme, herunder at plasmidet genformes til et cirkulært molekyle, uden noget DNA er blevet indsat.
Nogle plasmider er i stand til at eksistere i flere forskellige arter. De kaldes shuttle-vektorer og kan bruges til at flytte klonede DNA sekvenser mellem forskellige organismer, som for eksempel mellem bakterie-, gær-, og pattedyrsceller eller mellem bakterie-, svampe- og planteceller. Shuttle-vektorer kan være meget nyttige i processen med genetisk modificering af flercellede organismer, for eksempel når herbicidresistens indsættes i planter.
En anderledes vektor, er viralt DNA. Denne type vektor kan normalt acceptere meget større stykker fremmed DNA end pladsmider kan. Efter DNA er blevet indsat i den virale vektor, kan det klones i virussets værtsceller. Valget af en egnet vektor afhænger af mange faktorer, herunder den organisme, der skal modtage det nye gen og størrelsen af det DNA, der skal klones. Retrovirus, adenovirus og herpesvirus bliver brugt til at indsætte korrigerende gener i humane celler, der har defekte gener.
7.2.5 Polymerase kædereaktion
Polymerase kædereaktionen (PCR fra engelsk, Polymerase Chain Reaction) er en teknik, hvorved små prøver af DNA hurtigt kan amplificeres, det vil sige blive forøget til mængder der er store nok til analyse.
Startende med kun et gen-størrelses stykke DNA, kan PCR anvendes til at fremstille milliarder af kopier på kun et par timer. PCR processen er vist i figur 7.2.5.1.
Hver streng af mål DNA, tjener som en skabelon for DNA syntesen. Tilsat til dette DNA, er en forsyning af de fire nukleotider (til syntese af ny DNA) og enzymet der katalyserer DNA syntesen, der kaldes DNA polymerase. Korte stykker af nukleinsyrer kaldet primere tilsættes også, for at hjælpe med at starte reaktionen. Primere er komplementære til enderne af mål DNA’et og vil blive hybridiseret til enderne, der skal amplificeres. Derefter syntetiserer DNA polymerase nye komplementære strenge. Efter hver cyklus af syntesen, opvarmes DNA’et for at omdanne alt nysyntetiseret DNS til enkeltstrenge. Hver nysyntetiseret DNA streng tjener herefter som skabelon for flere nye DNA strenge.
Som et resultat heraf, fortsætter processen eksponentielt. Alle de nødvendige reagenser tilsættes et rør, som er placeret i et termisk cykliseringsapparat. Det termiske cykliseringsapparat kan indstilles til de ønskede temperaturer, tidspunkter og antal cyklusser. Anvendelse af et automatiseret termisk cykliseringsapparat er gjort mulig ved anvendelse af DNA polymerase taget fra en termofil bakterie, som for eksempel Thermus aquaticus; enzymet fra sådanne organismer kan overleve opvarmningsfasen uden at blive ødelagte. Tredive cyklusser, afslutte på bare et par timer, vil øge mængden af DNA med mere end en milliard gange.
Det amplificerede DNA kan ses ved gelelektroforese. I realtids PCR, eller kvantitativ PCR (qPCR), bliver den nyligt syntetiserede DNA markeret med et fluorescerende farvestof, så niveauet af fluorescens kan måles efter hver PCR cyklus (dette er realtidsaspektet). En anden PCR procedure kaldes revers-transskriptions-PCR og anvender viralt RNA eller en celles mRNA som skabelon. Enzymet revers transkriptase, laver DNA fra en RNA skabelon og DNA’et amplificeres herefter.
Bemærk, at PCR kun kan anvendes til at amplificere relativt små, specifikke sekvenser af DNA, som bestemt af primerne. Den kan ikke anvendes til at amplificere et helt genom.
PCR kan anvendes i enhver situation, der kræver amplifikation af DNA. Særligt bemærkelsesværdige er diagnostiske tests, der anvender PCR til påvisning af tilstedeværelsen af infektiøse agenser, hvor de ellers ikke ville være målbare. En qPCR test, giver hurtig identifikation af multiresistente Mycobacterium tuberculosis. Normalt kan det tage 6 uger at dyrke en kultur og det efterlader patienterne ubehandlede i en længere periode.