7.3.1 Indsættelse af fremmed DNA i celler
Rekombinerende DNA procedurer kræver, at DNA molekylerne manipuleres uden for cellen og derefter returneres til levende celler. Der er flere måder at indføre DNA i celler. Valget af metode, er normalt bestemt af den type vektor og værtscelle, der anvendes.
I naturen, kan plasmider sædvanligvis overføres mellem nært beslægtede mikroorganismer ved celle-til-celle kontakt, som for eksempel ved konjugation. For at ændre en celle, skal et plasmid indsættes i cellen ved transformation, en procedure hvorunder cellerne kan optage DNA fra det omgivende miljø. Mange celletyper, herunder E. coli, gær og pattedyrsceller, kan ikke naturligt omdannes; dog kan simple kemiske behandlinger gøre alle disse celletyper kompetente, eller i stand til at optage eksternt DNA. For E. coli er proceduren at udbløde dem i en opløsning af calciumchlorid i en kort periode. Efter denne behandling kan de nu kompetente celler, blandes med det klonede DNA og gives et mildt varmechok. Nogle af cellerne vil herefter optage DNA’et.
Der er andre måder at over DNA til celler på. En proces, der kaldes elektroporering, anvender en elektrisk strøm til at danne mikroskopiske porer i cellernes membraner; DNA’et vandrer herefter ind i cellerne gennem porerne. Elektroporation er generelt gældende for alle celler; dem med cellevægge skal dog oftest konverteres til protoplastre først. Protoplastre fremstilles ved, enzymatisk at fjerne cellevæggen, for derved at tillade mere direkte adgang til plasmamembranen.
Processen med protoplastfusion, drager også fordel af egenskaberne af protoplastre. Protoplastre i opløsning fusionerer ved en lav men signifikant rate; tilsætning af polyethylenglycol forøger hyppigheden af fusion (se figur 7.3.1.1). I den nye hybridcelle, kan DNA’et udledt fra de to forældreceller undergå naturlig rekombinering. Denne metode er især værdifuld ved genetisk manipulation af plante- og algeceller.
En bemærkelsesværdig metode til at indføre fremmed DNA i planteceller, er ved bogstaveligt, at skyde den direkte igennem de tykke cellulosevægge, ved hjælp af en genkanon (Se figur 7.3.1.2). Mikroskopiske partikler af wolfram eller guld, er belagt med DNA og drives af en byge af helium ind gennem cellevæggen. Nogle af cellerne udtrykker herefter det indførte DNA, som var det deres eget.
DNA kan indføres direkte i en dyrecelle ved mikroinjektion. Denne teknik kræver anvendelse af en glasmikropipette med en diameter, der er meget mindre end cellen. Mikropipetten punkterer plasmamembranen og injicerer DNA gennem hullet, se figur 7.3.1.3.
Der er således et stort udvalg af restriktionsenzymer, vektorer og fremgangsmåder til at indsætte Dna i celler. Men det fremmede DNA vil kun overleve, hvis det enten er til stede på en selvkopierende vektor eller er inkorporeret i et af cellens kromosomer ved rekombinering.
7.3.2 Fremskaffelse af DNA
Vi har nu kigget på, hvordan gener kan klones i vektorer, ved anvendelse af restriktionsenzymer og hvordan gener kan transformeres eller overføres til en række celletyper. Men hvordan får biologerne så de gener de er interesseret i? Der er to primære kilder til gener: (1) genomiske biblioteker med naturlige kopier af gener eller cDNA kopier af gener fremstillet fra mRNA og (2) syntetisk DNA.
Genomiske biblioteker
Isolering af specifikke gener som individuelle stykker af DNA er sjældent praktisk. Derfor starter forskere der er interesseret i gener fra en særlig organisme, med at ekstrahere organismens DNA, der kan opnås fra celler af en hver organisme, hvad enten det er planter, dyr eller mikroorganismer, ved at lysere cellerne og udfælde DNA. Denne proces, resulterer i en DNA masse, der omfatter hele organismens genom. Efter DNA’et er blevet nedbrudt af restriktionsenzymer, splejses restriktionsfragmenterne ind i et plasmid eller en fagvektor og rekombinerede vektorer indføres i bakterieceller. Målet er at gøre en samling af kloner stor nok til at sikre, at der eksisterer mindst en klon for hvert gen i organismen. Denne samling af kloner, der indeholder forskellige DNA fragmenter, kaldes et genomisk bibliotek: hver ”bog” er en bakteriel eller fagstamme, der indeholder et fragment af genomet, se figur 7.3.2.1. Sådanne biblioteker er afgørende for at opretholde og hente DNA kloner; de kan endda købes kommercielt.
Kloning af gener fra eukaryote celler repræsenterer et specifikt problem. Gener fra eukaryote celler, indeholder generelt både exoner, strækninger af DNA der koder for proteiner og introner, mellemliggende strækninger af DNA, der ikke koder for proteiner. Når RNA transskriptet af et sådan gen, omdannes til mRNA, fjernes intronerne. For at klone gener fra eukaryote celler, er det ønskeligt at anvende en version af genet, der mangler introner, fordi et gen der omfatter introner kan være for stort til nemt at arbejde med. Desuden, hvis et sådan gen indsættes i en bakteriecelle, vil bakterien normalt ikke være i stand til at fjerne intronerne ved RNA transskriptet. Derfor vil det ikke være i stand til at fremstille det rigtige proteinprodukt. Imidlertid kan et kunstigt gen, der kun indeholder exoner, fremstilles ved anvendelsen af et enzym der hedder revers transskriptase til syntetisering af komplementært DNA (cDNA) fra en mRNA skabelon (se figur 7.3.2.2). Denne syntese er den modsatte af den normale DNA-til-RNA transskriptionsproces. En DNA kopi fra mRNA, fremstilles med revers transkriptase. Efterfølgende nedbrydes mRNA’et enzymatisk. DNA polymerase syntetiserer herefter en komplementær streng af DNA, hvilket skaber et dobbeltstrenget stykke DNA indeholdende oplysningerne fra mRNA’et. Molekyler af cDNA fremstillet fra blandingen af alle mRNA stykkerne fra en vævs- eller celletype, kan herefter klones til dannelse af et cDNA bibliotek.
cDNA metoden, er den mest almindelige fremgangsmåde til opnåelse af eukaryote gener. En vanskelighed ved denne fremgangsmåde er, at lange molekyler af mRNA ikke fuldstændigt kan revers transskriberes til DNA; revers transskription afbrydes ofte og danner kun dele af det ønskede gen.
Syntetisk DNA
Under visse omstændigheder, kan gener fremstilles in vitro, ved hjælp af DNA syntesemaskiner (se figur 7.3.2.3). Et tastatur på maskinen, bruges til at indtaste den ønskede sekvens af nukleotider, meget lig bogstaver indtastet i et tekstbehandlingsprogram for at komponere en sætning. En mikroprocessor, styrer herefter syntesen af DNA fra oplagrede forsyninger af nukleotider og de andre nødvendige reagenser. En kæde på omkring 200 nukleotider kan syntetiseres ved denne fremgangsmåde. Med mindre genet er meget lille, skal der syntetiseres flere mindre kæder separat og efterfølgende forbindes i den rigtige rækkefølge, for at danne et helt gen.
Vanskeligheden ved denne fremgangsmåde er naturligvis, at sekvensen af genet skal være kendt inden det kan syntetiseres. Hvis genet ikke allerede er isoleret, så er den eneste måde at forudsige DNA sekvensen på, ved at kende aminosyresekvensen af genets proteinprodukt. Hvis denne aminosyresekvens er kendt, kan man i princippet arbejde sig baglens gennem den genetiske kode til opnåelse af DNA sekvensen. Desværre, forhindrer degenerering af koden en endelig fastlæggelse; for eksempel, hvis proteinet indeholder en leucin, hvilken af de sekt codoner der koder for leucin er så den korrekte i genet?
Af disse grunde er det sjældent at man kloner et gen ved at syntetisere det direkte, selv om nogle kommercielle produkter, som for eksempel insulin, interferon og somatostatin, er fremstillet af kemisk syntetiserede gener. Ønskede restriktionssteder tilføjes til de syntetiske gener, så generne kan indsættes i plasmidvektorer og klones i E. coli. Syntetisk DNA spiller en langt mere nyttig rolle i udvælgelsesprocedurer, som vi vil se senere.
7.3.3 Udvælgelse af en klon
I kloning, er det nødvendigt at udvælge den særlige celle, der indeholder det specifikke gen af interesse. Dette er vanskeligt at gøre, fordi det ud af millioner af celler, måske kun er meget få der indeholder det ønskede gen. Her vil vi kigge på en typisk screeningsprocedure, kaldet blå-hvid screening, ud fra farven på de bakterielle kolonier dannet i slutningen af screeningsprocessen.
Plasmidvektoren indeholder et gen (ampR), der koder for resistens over for antibiotikummet ampicillin. Vækstbakterien vil ikke være i stand til at vokse på testmediet, der indeholder ampicillin, med mindre vektoren har overført ampicillinresistensgenet. Plasmidvektoren indeholder også et andet gen, dette for enzymet β-galactosidase (lacZ). Bemærk i figur 7.2.4.1, at der er flere steder i lacZ, der kan skæres af restriktionsenzymer.
I proceduren blå-hvid screening, der er vist i figur 7.3.3.1, dyrkes et bibliotek af bakterier i et medie der kaldes X-gal. X-gal indeholder to essentielle komponenter, ud over dem der er nødvendige for bakteriel vækst. Det ene er det antibiotiske ampicillin, der forhindrer væksten af en hver bakterie der ikke har modtaget ampicillinresistensgenet fra plasmidet. Den anden, kaldet X-gal, er et substrat for β-galactosidase.
Kun bakterier, der har samlet plasmidet op vil vokse, fordi de nu er ampicillinresistente. Bakterier der har opsamlet det rekombinerede plasmid – hvor det nye gen blev indsat i lacZ genet – vil ikke hydrolysere laktose og vil danne hvide kolonier. Hvis en bakterie har optaget det oprindelige plasmid, der indeholder det intakte lacZ gen, vil cellerne kunne hydrolysere X-gal og danner en blåfarvet forbindelse; kolonien vil altså blive blå.
Hvad der nu mangler at blive gjort, kan stadig være svært. Ovennævnte procedure har isoleret hvide kolonier, der vides at indeholde den fremmede DNA, men det er stadig uvist, om det er det ønskede fragment af fremmed DNA. En anden procedure er derfor nødvendig for at identificere disse bakterier. Hvis det fremmede DNA i plasmidet, koder for produktionen af et identificerbart produkt, skal det bakterielle isolat kun dyrkes i en kultur og testes. Men i nogle tilfælde, skal selve genet være identificeret i værtsbakterien.
Kolonihybridisering er en almindelig metode til identifikation af celler, der bærer et specifikt klonet gen. DNA sonder, der er korte segmenter af enkeltstrenget DNA, der er komplementære til det ønskede gen, syntetiseres. Hvis DNA sonden finder et match, vil den klæbe til målgenet. DNA sonden er mærket med et enzym eller et fluorescerende farvestof, så man kan detektere dets tilstedeværelse. Et typisk kolonihybridiseringseksperiment er vist i figur 7.3.3.2. En matrix af DNA sonder anbragt i en DNA chip, kan bruges til at identificere patogener.
7.3.1 Fremstilling af et genprodukt
Vi har netop set, hvordan man kan identificere celler, der bærer et bestemt gen. Genproduktet er ofte målet med genetisk modifikation. De fleste af de tidligste arbejder til genetisk modifikation, anvendte E. coli til at syntetisere genprodukterne. E. coli kan nemt dyrkes og forskerne er meget fortrolig med bakterien og dens genetik. For eksempel er nogle inducerbare promotorer, som for eksempel lac-operonen, blevet klonet og klonede gener kan bindes til sådanne promotorer. Syntesen af store mængder af det klonede genprodukt, han herefter styres ved tilsætning af en inducer. En sådan fremgangsmåde, er blevet anvendt til fremstilling af gammainterferon i E. coli (se figur 7.3.1.1). Imidlertid har E. coli også flere ulemper. Ligesom andre Gramnegative bakterier, producerer den endotoksiner som en del af det ydre lag af dens cellevæg. Fordi endotoksiner kan forårsage feber og shock i pattedyr, ville deres utilsigtede tilstedeværelse i produkter til humant brug, være et alvorligt problem.
En anden ulempe ved E. coli, er at den normalt ikke udskiller proteinprodukter. For at kunne opnå et produkt, skal cellerne normalt brydes i stykker og produktet oprenses af den resulterende ”suppe” af cellekomponenter. Udvinding af produktet fra en sådan blanding er dyr, når det skal gøres i en industriel målestok. Det er mere økonomisk, at have en organisme der udskiller produktet, så det kan udvindes kontinuerligt fra vækstmediet. En metode har været, at knytte produktet til et naturligt E. coli protein, som bakterien ikke udskiller. Imidlertid er Grampositive bakterier, som for eksempel Bacillus subtilis, mere tilbøjelige til at udskille deres produkter og foretrækkes derfor ofte industrielt.
En anden mikroorganisme, der bliver brugt til at udtrykke rDNA, er bagegær, Saccharomyces cerevisiae. Dens genom er kun omkring fire gange større end det for E. coli og er sandsynligvis det bedst forståede eukaryote genom. Gær kan bære plasmider, der let overføres til gærceller, hvis cellevæggen er blevet fjernet. Som eukaryot celle, kan gær være meget mere succesfuld i at udtrykke fremmede gener, end bakterier. Endvidere, vil gær sandsynligvis kontinuerligt udskille produktet. På grund af alle disse faktorer, er gær blevet den foretrukne eukaryote arbejdshest i bioteknologien.
Pattedyrsceller i kultur, selv humane celler, kan modificeres genetisk meget lig bakterier for at producere forskellige produkter. Forskere har udviklet effektive metoder til dyrkning af visse pattedyrsceller i kulturer, som værter for voksende virus. Pattedyrsceller er ofte de bedst egnede til at lave proteinprodukter til medicinsk brug, fordi cellerne udskiller deres produkter og fordi der er lav risiko for toksiner eller allergener. Brug af pattedyrsceller for at lave fremmede genprodukter i industriel målestof, kræver ofte et indledende trin med kloning af genet i bakterier. Kig på eksemplet med kolonistimulerende faktor (CSF). Som et protein produceret naturligt i små mængder af hvide blodlegemer, er CSF værdifuldt, fordi det stimulerer væksten af visse celler, der beskytter mod infektion. At producere enorme mængder af CSF industrielt, skal genet først indsættes i et plasmid. Bakterier bruges til at lave flere kopier af plasmidet (se figur 7.1.2.1) og de resulterende rekombinerede plasmider, indsættes derefter i pattedyrsceller, der er dyrket kunstigt i flasker.
Planteceller kan også dyrkes i kultur, ændres af rDNA teknikker og derefter anvendes til at fremstille genetisk modificerede planter. Sådanne planter, kan vise sig at være nyttige kilder til værdifulde produkter, som for eksempel vegetabilske alkaloider (det smertestillende kodein, for eksempel), de isoprenoider, der er grundlaget for syntetisk gummi og melanin (animalsk hudpigment) til brug i solcremer. Genetisk modificerede planter har mange fordele til produktion af humane terapeutiske midler, herunder vacciner og antistoffer. Fordelene omfatter stor skala, lav omkostning i landbrugsproduktion og lav risiko for forurening af produktet med pattedyrspatogener eller kræftfremkaldende gener. Genetisk modifikation af planter, kræver ofte brug af en bakterie.