Vi har nu kigget på hele sekvensen af begivenhederne i kloning af et gen. Som angivet tidligere, kan sådanne klonede gener, anvendes på en række forskellige måder. En er at producere nyttige produkter mere effektivt og billigere. En anden er at indhente oplysninger fra det klonede DNA, der er nyttigt enten for grundforskning, medicin eller retsvidenskab. En tredje er at anvende klonede gener til at ændre egenskaberne for en celle eller organisme.
7.4.1 Terapeutiske anvendelser
Et yderst værdifuldt farmaceutisk produkt er hormonet insulin, et lille protein der produceres af bugspytkirtlen, som styrer kroppens optag af glucose fra blodet. I mange år, har mennesker med insulinkrævende diabetes, kontrolleret deres sygdom ved at injicere insulin fra bugspytkirtler på slagtede dyr. Denne opnåelse af insulin er en dyr proces og insulinet fra dyr er ikke så effektivt som humant insulin.
På grund af værdien af humant insulin og proteinets lille størrelse, var det et tidligt mål for den farmaceutiske industri, at kunne producere insulin ved rDNA teknikker. For at producere hormonet, blev syntetiske gener først konstrueret for hver af de to korte peptidkæder, der udgør insulinmolekylet. Den lille størrelse på disse kæder – kun henholdsvis 21 og 30 aminosyrer lange – gjorde det muligt at anvende syntetiske gener. Ved at følge fremgangsmåden tidligere beskrevet, blev hver af de to syntetiske gener indsat i en plasmidvektor og bundet til enden af et gen, der kodede for det bakterielle enzym β-galactosidase, således at insulinpolypeptidet blev produceret samtidigt med enzymet. To forskellige E. coli bakteriekulturer blev anvendt, en til fremstilling af hver af de to insulinpolypeptidkæder. Polypeptiderne blev herefter udvundet fra bakterierne, adskilt fra β-galactosidase og kemisk sammensat for at fremstille det humane insulin. Denne bedrift, var en af de tidlige kommercielle succeser for DNA teknologien og den illustrerer en række af de principper og procedurer, der omtales i denne del.
Et andet humant hormon, der nu produceres kommercielt ved genetisk modificering af E. coli er somatostatin. På et tidspunkt, var der behov for 500.000 fårehjerner for at producere 5 mg af animalsk somatostatin til forsøgsformål. Derimod, kræves der nu kun omkring 8 liter af en genetisk modificeret bakteriekultur, for at opnå den ækvivalente mængde af den humane udgave af hormonet.
Underenhedsvacciner, der kun består af en proteindel af et patogen, fremstilles af modificeret gær. Underenhedsvacciner er blevet fremstillet for en række sygdomme, især hepatitis B. En af fordelene ved en underenhedsvaccine er, at der ikke er nogen chance for, at vaccinen vil forårsage en infektion. Proteinet høstes fra de genetisk modificerede celler og oprenses til anvendelse som en vaccine. Animalske vira, som for eksempel vaccinia virus, kan modificeres genetisk til at bære et gen for en anden mikroorganismes overflade protein. Når det injiceres, fungerer virussen som en vaccine mod den anden mikroorganisme.
DNA vacciner, er normalt cirkulære plasmider, der omfatter et gen der koder for et viralt gen, der re under kontrol af en transkriptionel promotorregion som er aktiv i humane celler. Plasmiderne klones herefter i bakterier. Adskillige vaccineforsøg mod HIV, influenza, hepatitis, dengue feber, brystkræft og malaria udføres. Tabel 7.4.1.1 lister nogle andre vigtige rDNA produkter, der anvendes til medicinsk behandling.
Betydningen af rDNA teknologi til medicinsk forskning, kan ikke understreges nok. Kunstigt blod til anvendelse i transfusioner kan nu fremstilles med humant hæmoglobin produceres i genetisk modificerede grise. Får er også blevet genetisk modificeret til at producere en række lægemidler i deres mælk. Denne procedure, har tilsyneladende ingen virkning på får og de giver en let anvendelig kilde til råmaterialet for det produkt, så man undgår at skulle slå dyrene ihjel for at udvinde produkterne.
Genterapi kan i sidste ende, blive en kur for nogle genetiske sygdomme. Det er muligt at forestille sig, at man fjerner nogle celler fra en person og omdanner dem med et normalt gen, for at erstatte et defekt eller muteret gen. Når disse celler returneres til den person, bør de herefter fungere normalt. For eksempel har genterapi været anvendt til behandling af hæmofili B og alvorlig kombineret immundefekt. Adenovira og retrovira, anvendes ofte til afgivelse af gener; dog arbejder nogle forskere med plasmidvektorer. En svækket retrovirus blev anvendt som vektoren, da den første genterapibehandling af hæmofili hos mennesker blev udført på mennesker i 1990. Adskillige forsøg med genterapi er i gang, hvor der anvendes genetisk modificerede adenovira som bærere af humane gener til behandling af retinale sygdomme, til at erstatte et hjerteprotein og til at behandle den degenerative hjertesygdom, kaldet Canavans sygdom. Antisense DNA, der indføres i celler, er også ved at blive undersøgt til behandling af hepatitis, hudkræft og forhøjet kolesterol.
Indtil videre har genterapiresultaterne dog ikke været imponerende; der har endda været dødsfald som tilskrives de virale vektorer. En stor del indledende arbejde mangler at blive udført, men helbredelse af alle genetiske sygdomme er måske ikke muligt.
Geninaktivering er en naturlig proces, der forekommer i en lang række eukaryoter og er tilsyneladende et forsvar mod virus og transposoner. Geninaktivering ligner miRNA, ved at et gen der koder et lille stykke RNA transskriberes. Efter transskriberingen, dannes små interfererende RNA stykker (siRNA) efter bearbejdning af en enzym kaldet Dicer. siRNA molekylerne binder sig til mRNA, som derefter ødelægges af proteiner kaldet RNA induceret inaktiveringskompleks (RISC) og således inaktiverer udtrykket af et gen, se figur 7.4.1.1.
En ny teknologi, kaldet RNA interferens (RNAi) virker lovende til genterapibehandling af genetiske sygdomme. Et lille DNA stykke, der koder for siRNA’et for genet af interesse, kan klones i et plasmid. Når det overføres til en celle, vil cellen frembringe den ønskede siRNA. Kliniske forsøg gennemføres i øjeblikket for at teste RNAi i behandling af muculadegeneration og melanom.
7.4.2 Genomprojekter
Det første genom der blev sekventeret var fra en bakteriofag i 1977. I 1995 blev genomet fra en fritlevende celle – Haemophilus influenzae – sekventeret. Siden da er 1.000 prokaryote genomer og over 400 eukaryote genomer blevet sekventeret.
I shotgun sekventering, bliver små stykker af et genom fra en fritlevende celle sekventeret og sekvenserne samles herefter i en computer. Eventuelle huller i genomet efter samlingen, er man herefter nødt til at finde og sekventere (se figur 7.4.2.1). Denne teknik kan anvendes på miljøprøver for at studere genomerne af mikroorganismer, som ikke har været dyrket. Studiet af genetisk materiale taget direkte fra miljøprøver, kaldes metagenomik.
Human Genome projektet var en internationalt 13-årig indsats, formelt begyndt i 1990 og afsluttet i 2003. Målet med projektet var at sekventere hele det human genom, cirka 3 milliarder nukleotidpar, bestående af 20.000 til 25.000 gener. Tusindvis af mennesker i 18 lande deltog i dette projekt. Forskerne indsamlede blod- (fra kvinder) eller sæd- (fra mænd) prøver fra et stort antal donorer. Kun få prøver blev behandlet som DNA ressourcer og kildenavnene er beskyttede, så hverken donorer eller forskere vidste hvis prøver der blev anvendt. Udviklingen af shotgun sekventering fremskyndede kraftigt processen og omkring 99% af genomet er nu blevet sekventeret.
En overraskende opdagelse var, at mindre end 2% af genomet koder for et funktionelt produkt – de sidste 98% omfatter miRNA gener, virale rester, gentagne sekvenser (kaldet for korte tandemsekvenser), introner, kromosomenderne (kaldet telomerer) og transposoner. I øjeblikket er forskerne ved at lokaliserer specifikke gener og kortlægge deres funktioner.
Det næste mål for forskerne er ”the Human Proteome Project”, som skal kortlægge alle de proteiner, der udtrykkes i humane celler. Selv før det er færdigt, giver det data som er af enorm værdi for vores forståelse af biologien. Det vil også i sidste ende være af stor medicinsk gavn, især til diagnose og behandling af genetiske sygdomme.
7.4.2 Videnskabelige anvendelser
Rekombineret DNA teknologi kan anvendes til fremstilling af produkter, men det er ikke den eneste betydningsfulde anvendelse. På grund af sin evne til at producere mange kopier af DNA, kan den tjene som en slags DNA ”trykpresse”. Når en stor mængde af et bestemt stykke DNA er tilgængelig, kan de forskellige analytiske processer der omtales i dette afsnit, anvendes til at ”læse” oplysningerne i DNA’et.
I 2010, syntetiserede forskere det mindste kendte cellulære genom under ”Minimal Genome Project”. En kopi af Mycoplasma mycoides genomet blev syntetisereret og transplanteret ind i en M. Capricolum celle, der havde fået sin egen DNA fjernet. Den modificerede celle producerede M. mycoides proteiner. Dette forsøg viste, at store ændringer i et genom kan foretages og at en eksisterende celle vil acceptere dette nye DNA.
DNA sekventering har fremskaffet en enorm mængde information, der har skabt det nye felt, bioinformatik, videnskaben med at forstå genernes funktioner gennem computerassisteret analyse. DNA sekvenser gemmes i en web-baseret database benævnt GenBank. Der kan søges efter genomiske oplysninger med computerprogrammer, for at finde specifikke sekvenser, eller til at søge efter lignende mønstre i genomerne af forskellige organismer. Mikrobielle gener, bliver nu gennemsøgt, for at finde de molekyler der er de virulente faktorer i patogener. Ved at sammenligne genomer, har forskere opdaget, at Chlamydia trachomatis producerer et toksin svarende til det i Clostridium difficile.
Det næste mål er at identificere proteinerne kodet af disse gener. Proteomforskning er videnskaben med at bestemme alle proteiner udtrykt i en celle.
Revers genetik, er en tilgang til at opdage funktionen af et gen, fra en genetisk sekvens. Revers genetik forsøger at fastslå forbindelsen til en given genetisk sekvens med særlige virkninger for organismen. For eksempel, hvis du muterer eller blokerer et gen, kan du se efter en karakteristisk egenskab som organismen har tabt.
Et eksempel på anvendelse af human DNA sekventering, er identifikationen og kloningen af det mutante gen, der forårsager cystisk fibrose (CF). CF er kendetegnet ved oversekretering af slim, hvilket fører til blokerede respiratoriske passager. Sekvensen af det muterede gen, kan anvendes som et diagnostisk værktøj i en hybridiserings teknik, kaldet Southerns blotting (Se figur 7.4.2.1), opkaldt efter Ed Southern, der udviklede teknikken i 1975.
Ved denne teknik, bliver emnets DNA nedbrudt med et restriktionsenzym, hvilket giver tusindvis af fragmenter med forskellige størrelser. Fragmenterne kaldes RFLP’er (udtales ”rif-lips”), som er en forkortelse for restriktions-fragment-længde-polymorfismer. De forskellige fragmenter adskilles herefter ved gelelektroforese. Fragmenterne sættes i en celle, i den ene ende af et lag af agarosegel. En elektrisk strøm ledes så igennem gelen. Så længe strømmen er tilsluttet, vandrer de forskellige størrelser RFLP’er gennem gelen, med forskellige hastigheder. RFLP’erne overføres på et filter ved at duppe og bliver markeret med en særlig DNA sonde, fremstillet ud fra genet af interesse, i dette tilfælde CF genet. Sonden vil hybridisere sig til dette mutante gen, men ikke til det normale gen. Fragmenter, som sonden bindes til kan identificeres ved et farvestof. Med denne metode, kan enhver persons DNA testes for tilstedeværelsen af det muterede gen.
Gentests kan nu anvendes til at screene for flere hundrede forskellige genetiske sygdomme. Sådanne screeningsprocedurer kan udføres på vordende forældre med også på fosterets væv. To af de mere almindelit screenede gener er dem der er associeret med arvelige former for brystkræft og genet ansvarligt for Huntingtons sygdom. Gentests kan hjælpe en læge med at ordinere den rigtige medicin til en patient. Lægemidlet Herceptin, for eksempel, er kun effektivt hos brystkræftpatienter med en specifik nukleotidsekvens i HER2 genet.
Retsmedicinsk mikrobiologi
I flere år, har mikrobiologer brugt RFLP’er i en metode til identifikation, kendt som DNA fingeraftryk, for at identificere bakterielle eller virale patogener (Se figur 7.4.2.2).
DNA chips eller PCR mikroarrays, der kan screene en prøve for flere forskellige patogener på en gang bliver nu anvendt. I en DNA chip, kan op til 22 primere fra forskellige mikroorganismer anvendes, til at initiere PCR. En mistænkt mikroorganisme kan identificeres, hvis DNA kopieres fra en af primerne. På det amerikanske Centers for Disease Control and Preventions (CDC) PulseNet, bruges RFLP’er til at spore udbrud af fødevarebårne sygdomsudbrud. I nogle tilfælde kan PCR under anvendelse af specifikke primere, anvendes til at spore en bakteriestamme for at lokalisere kilden til et udbrud.
Genomforskning i patogener, er blevet en grundpille i overvågning, forebyggelse og styring af smitsomme sygdomme. Det nye felt af mikrobiologisk retsmedicin er blandt andet udviklet, fordi hospitaler, fødevareproducenter og enkeltpersoner i USA, kan sagsøges i domstolene og fordi mikroorganismer kan bruges som våben. Mikrobiologisk retsmedicin har været brugt i retten et par gange. I 1990’erne blev DNA fingeraftryk af HIV brugt første gang for at opnå en voldtægtsdomsfældelse. Siden da, er en læge blevet dømt for at injicere sin tidligere elsker med HIV fra en af sine patienter, baseret på DNA fingeraftryk af HIV. I 2001, blev DNA fingeraftryk af Bacillus anthracis, brugt til at spore kilden for et miltbrandangreb i USA og derefter den påståede angriber. Forskere på Northern Arizona University konstaterede i 1993, at B. anthracis endosporer der anvendtes af en kult i Japan, faktisk var en ikke-patogen stamme brugt til vaccine. Ingen kom derfor til skade, da endosporerne blev frigivet. I øjeblikket, bliver der udviklet en DNA database over de mikroorganismer, der kunne bruges ved biologiske forbrydelser.
Kravene for at bevise kilden til en mikroorganisme i en retssal, er strengere end på det medicinske område. For eksempel, for at bevise forsæt til at påføre skade, skal bevismaterialerne indsamles korrekt og der skal etableres en kæde af begivenheder i forhold til dette bevismateriale. Mikrobielle egenskaber, som er uden betydning i den offentlige sundhedssektor, kan være vigtige spor i retsmedicinske undersøgelser. Det amerikanske Academy of Microbioloy foreslog fornylig, at der oprettes en særlig professionel certificering inden for retsmedicinsk mikrobiologi.
DNA kan ofte ekstraheres fra konserverede og forstenede materialer, herunder mumier og uddøde planter og dyr. Selvom et sådant materiale er meget sjældent og i reglen delvist nedbrudt, giver PCR forskerne mulighed for at studere miljøer og organismer, der ikke længere eksisterer i deres naturlige form. Studiet af usædvanlige mikroorganismer, har også ført til fremskridt i den grundlæggende taksonomi (navngivning).
Nanoteknologi
Nanoteknologi handler om design og fremstilling af ekstremt små elektriske kredsløb og mekaniske anordninger, opbygget på det molekylære niveau af stof. Robotter eller computere i molekylestørrelse, kan anvendes til at detektere kontaminering i fødevarer, sygdomme i planter eller biologiske våben. Men de små maskiner (en nanometer er 10-9 meter, 1.000 nm svarer til 1µm) kræver små ledninger og komponenter. Bakterier kan give de nødvendige små metalkomponenter. Forskere ved US. Geological Survey, har dyrket flere anaerobe bakterier, der reducerer det giftige Se4+ til det ugiftige grundstof Se0, som dannes i nanokugler (se figur 7.4.2.3). Forskning i nanoteknologi vokser i takt med at forskere udvikler innovative metoder til at anvende bakterier for at producere nanokugler til potentiel lægemiddelmålretning og levering. Forskere i US Department of Energy, bruger Acetobacter xylinum til at bygge cellulosenanofibre til kunstige blodkar.
7.4.3 Anvendelser i landbruget
Processen med at udvælge genetisk ønskelige planter, har altid været meget tidskrævende. Traditionelt er krydsning af planter, en besværlig metode og indebærer at man skal vente på at et plantet frø spirer og den resulterende plante bliver voksen, før man kan lære om den frembragte plante har de ønskede egenskaber. Planteavl er blevet revolutioneret ved brug af planteceller dyrket i kultur. Kloner af planteceller, herunder celler der er blevet genetisk ændret med rDNA teknikker, kan dyrkes i store antal. Disse celler kan herefter induceres til at regenerere hele planter, hvorfra frø kan høstes.
Rekombineret DNA kan indføres i planteceller på flere forskellige måder. Tidligere har vi nævnt protoplastfusion og anvendelse af DNA coatede ”kugler”. Den mest elegante metode, er dog brugen af et plasmid, kaldet Ti-plasmidet (Ti står for tumor inducerende), der forekommer naturligt i bakterien Agrobacterium tumefaciens. Denne bakterie inficerer visse planter, hvori Ti-plasmidet forårsager dannelsen af en tumorlignende vækst, kaldet en krone galde (se figur 7.4.3.1). En del af Ti-plasmidet, kaldet T-DNA, integreres i genomet af den inficerede plante. T-DAN stimulerer lokal cellulær vækst (krongalden), og samtidig forårsager den produktionen af visse produkter, der anvendes af bakterien som en næringsmæssig kulstof- og nitrogenkilde.
For planteforskere, er det attraktive ved Ti-plasmidet, at den tilvejebringer et instrument til indføring af rDNA ind i en plante (se figur 7.4.3.2). En forsker kan indsætte fremmede gener i T-DNA’et og sætte de rekombinerede plasmid tilbage i Agrobacterium-cellen og dermed bruge bakterien til at indsætte det rekombinerede Ti-plasmid i en plantecelle. Plantecellen med det fremmede gen, kan dernæst anvendes til at frembringe en ny plante. Med lidt held, vil den nye plante udtrykke det fremmede gen. Desværre kan Agrobacterium ikke naturligt inficere græsser, så den kan ikke bruges til at forbedre kornafgrøder som hvede, ris eller majs.
Bemærkelsesværdige resultater af denne tilgang, er tilførsel af resistens over for herbicidet glyposat hos planter. Normalt dræber herbicidet både ukrudt og nytteplanter ved at hæmme den nødvendige fremstilling af visse essentielle aminosyrer. Nogle salmonellabakterier har tilfældigvis dette enzym, men det er resistent over for herbicidet. Når DNA for dette enzym indføres i en nytteplante, bliver nytteplanten også resistent over for herbicidet, som derefter kun dræber ukrudtet. Bacillus thuringiensis bakterier, er patogene for nogle insekter, fordi de producerer et protein kaldet Bt-toksin, der forstyrrer insekters fordøjelseskanal. Bt-genet er blevet indsat i en række nytteplanter, herunder bomuld og kartofler, så insekter der æder planten dør. Der er nu fremstillet en række planter, hvor herbicid- og pesticidresistensen er blevet manipuleret. Resistens over for tørke, virusinfektion og andre miljømæssige belastninger, er også blevet manipuleret ind i nytteplanter.
Et andet eksempel, involverer MacGregor tomater, der forbliver faste efter høst, fordi genet for polygalacturonase (PG), der er det enzym der nedbryder pektin, undertrykkes. Undertrykkelsen blev opnået ved antisense DNA teknologi. Først syntetiseres et stykke DNA komplementært til PG mRNA’et. Dette antisense DNA optages herefter af cellen og bindes til mRNA for at inhibere translation. DNA-RNA hybriden nedbrydes af cellens enzymer, hvilket frigør antisense DNA’et så det kan inaktivere et andet mRNA.
Den måske mest spændende potentielle anvendelse af genetisk modificerede planter, vedrører nitrogenfiksering, der er evnen til at omdanne atmosfærisk nitrogen, til forbindelser som levende organismer kan bruge. Tilgængeligheden af sådanne nitrogenholdige stoffer, er normalt den vigtigste faktor der begrænser nytteplantevækst. Men i naturen er det kun visse bakterier, der kar gener som tillader dem at udføre denne proces. Nogle planter, som for eksempel lucerner, kan drage fordel af et symbiotisk forhold med disse mikroorganismer. Arter af den symbiotiske bakterie Rhizobium, er allerede blevet genetisk modificeret, for at øge nitrogenfikseringen. I fremtiden kan Rhizobium-stammer designes så de kan kolonisere sådanne nytteplanter som majs og hvede og helt eliminere deres krav til nitrogengødning. Det endelige mål, er at indføre fungerende gener til nitrogenfiksering, direkte i planterne. Selvom dette mål endnu ikke kan nås med vores nuværende viden, vil arbejdet hen mod det, fortsætte på grund af dets potentiale for drastisk at øge verdens fødevareforsyning.
Et eksempel på en genetisk modificeret bakterie der nu bruges i landbruget, er Pseudomonas fluorescens, der er blevet manipuleret til at producere Bt-toksin, der normalt produceres af Bacillus thuringiensis. Dette toksin dræber visse insekter, som for eksempel den europæiske majsborer. Den genmodificerede Pseudomonas, der producerer meget mere toksin end B. thuringiensis, kan tilsættes til plantefrø og vil med tiden komme ind i karsystemet på den voksende plante. Dens toksin indtages af de majsborerlarver der spiser af planten og dræber dem (men toksinet er samtidigt uskadeligt over for mennesker og dyr).
Dyrehold har også nydt godt af rDNA teknologi. Vi har tidligere beskrevet, hvordan et af de tidligste kommercielle produkter af rDNA, var humant væksthormon. Ved tilsvarende fremgangsmåder, er det muligt at fremstille bovint væksthormon (bGH). Når bGH indsprøjtes i kødkvæg, øger det deres vægt; i malkekøer, medfører det også en stigning i mælkeproduktionen på 10%. Sådanne procedurer er blevet mødt med modstand fra forbrugerne, primært som følge af en – endnu udokumenteret – frygt for, at noget af bGH’et ville være tilstede i mælken eller kødet hos disse dyr og at det ville kunne være skadeligt for mennesker.
Tabel 7.4.3.1 lister disse og flere andre rDNA produkter, der anvendes i landbruget og i dyrehold.
