En klassifikationsoversigt indeholder en liste over egenskaber og et middel til sammenligning for at hjælpe med at identificere en organisme. Når organismen er identificeret, kan den placeres i en tidligere udtænkt klassifikation. Mikroorganismer identificeres til praktiske formål, for eksempel for at bestemme en passende behandling af en infektion. De bliver ikke nødvendigvis identificeret, ved de samme teknikker ved hvilke de bliver klassificeret. De fleste procedurer for identifikation, kan let udføres på et laboratorium og ved at bruge så få procedurer og prøver som muligt. Protozoer, indvoldsorm og svampe, kan normalt identificeres mikroskopisk. De fleste prokaryote organismer distinktive morfologiske træk eller varierer ikke meget i størrelse og form. Derfor har mikrobiologer udviklet en række forskellige metoder, til at teste metaboliske reaktioner og andre karakteristika til at identificere prokaryoter.
Bergey’s Manual of Determinative Biology har været en udbredt henvisning, siden den første udgave blev offentliggjort i 1923. Bergey’s Manual klassificerer ikke bakterier efter evolutionære slægtsskaber, men giver i stedet identifikationslister (bestemmende) baseret på sådanne kriterier som cellevæggens sammensætning, morfologi, differentialfarvning, iltbehov og biokemiske tests. De fleste organismer i Bacteria og Archaea er aldrig blevet dyrket og videnskabsfolk har beregnet, at kun 1% af disse organismer er blevet opdaget.
Medicinsk mikrobiologi (den gren af mikrobiologien der beskæftiger sig med humane patogener), da domineret interessen for mikroorganismer og denne interesse afspejles i mange identifikationslister. Men for at sætte de sygdomsfremkaldende egenskaber hos bakterier i perspektiv, er færre end 5% af de mere end 11.500 arter, opført i de godkendte lister over bakterielle navne, humane patogener.
Vi beskriver nu flere kriterier og metoder til klassificering og rutineidentifikation af mikroorganismer. Foruden egenskaberne af selve organismen, er kilden og levestedet for et bakterielt isolat en del af identifikationsprocessen. I klinisk mikrobiologi, vil en læge opsamle en patients pus eller stryge en vævsoverflade med en vatpind. Vatpinden indsættes i et rør med et transportmedium. Transportmedier har normalt ikke nogen næringsværdi, men er designet til at forlænge levedygtigheden af kræsne patogener. Lægen vil notere typen af prøve og hvilke tests der ønskes udført på en særlig laboratorieprøveformular (et eksempel på en hvordan en sådan formular kunne se ud, er vist i figur 8.2.1). Laborantens resultater vil hjælpe læget til at begynde den korrekte behandling.
8.2.1 Morfologiske karakteristika
Morfologiske (strukturelle) karakteristika, har hjulpet taksonomer med at klassificere organismer i 200 år. Højere organismer, klassificeres ofte efter observationer af anatomiske detaljer. Men mange mikroorganismer, ser alt for ens ud, til at blive klassificeret ud fra deres struktur alene. Organismer, der kunne afvige i metaboliske eller fysiologiske egenskaber, kan se ens ud under et mikroskop. Bogstavelig talt er hundredevis af bakteriearter små stave eller små kokker.
Større størrelser og tilstedeværelsen af intracellulære strukturer, er dog ikke altid ensbetydende med en lettere klassificering. Pneumocytis pneumonia er den mest almindelige opportunistiske infektion i AIDS og andre immunkompromitterede patienter. Indtil AIDS epidemien, blev den forårsagende agens for denne infektion, P. jirovecii [tidligere ”P. carinii”] sjældent set hos mennesker. Pneumocytis mangler strukturer der let kan anvendes til identifikation og dens taksonomiske position har været usikker sidens dens opdagelse i 1909. Den blev oprindeligt klassificeret som en protozo; dog viste rRNA sekventering i 1988, at Pneumocytis faktisk er medlem af riget Fungi. Nye behandlinger der tager denne organismes slægtsskab til svampe i betragtning, er ved at blive undersøgt af forskere.
Cellemorfologi fortæller os kun lidt om fylogenetiske relationer. Men morfologiske karakteristika er stadig anvendelige ved identifikation af bakterier. For eksempel kan forskelle i sådanne strukturer som endosporer eller flageller være nyttig information.
8.2.2 Differentialfarvning
Et af de første skrift i at identificere bakterier er differentieret farvning (se del 2.3.3). De fleste bakterier er enten Grampositive eller Gramnegative. Andre differentielle farvninger, som for eksempel syrefastfarvning, kan være nyttig for en mere begrænset gruppe af mikroorganismer. Husk på, at disse farvemetoder er baseret på den kemiske sammensætning af cellevægge og er derfor ikke brugbare til identifikation af bakterier uden cellevægge eller medlemmer af Archaea der har usædvanlige cellevægge. Mikroskopiske undersøgelse af en Gramfarvning eller syrefast farvning, anvendes til at indhente hurtige oplysninger i det kliniske miljø.
8.2.3 Biokemiske tests
Enzymatiske aktiviteter, er almindeligt anvendt til at differentiere bakterier. Selv nært beslægtede bakterier kan normalt opdeles i særskilte arter, ved at underkaste dem biokemiske tests. For eksempel anvendes biokemiske tests, til at identificere bakterier i mennesker og havpattedyr. Desuden kan biokemiske tests, give indsigt i en arts niche i økosystemet. For eksempel vil en bakterie der kan fiksere nitrogengas eller oxidere svovl, kunne give vigtige næringsstoffer til planter og dyr.
Enteriske, Gramnegative bakterier, er en stor heterogen gruppe af mikroorganismer, hvis naturlige habitat er tarmkanalen hos mennesker og dyr. Denne familie indeholder flere patogener, der forårsager diarrésygdomme. Der er udviklet en lang række tests, så laboranter hurtigt kan identificere disse patogener. En læge kan herefter give en passende behandling og epidermiologer kan lokalisere kilden til en sygdom. Alle medlemmer af familien Enterobacteriaceae er oxidasenegative. Blandt de enteriske bakterier er medlemmer af slægterne Escherichia, Enterobacter, Shigella, Citrobacter og Salmonella. Escherichia, Enterobacter og Citrobacter kan forgære laktose og producerer syre og gas og dermed skelnes fra Salmonella og Shigella der ikke kan. Yderligere biokemiske tests som vist i figur 8.2.3.1 kan skelne mellem slægter.
Den nødvendige tid for identifikation, kan reduceres betydeligt ved brug af selektive og differentierende medier, eller ved hurtige identifikationsmetoder. Selektive medier indeholder ingredienser, der undertrykker væksten af konkurrerende organismer og fremmer væksten af de ønskede organismer. Differentierende medier tillader den ønskede organisme at vokse til en koloni, der har et eller andet specielt særpræg.
Bergey’s Manual vurderer ikke den relative betydning af hver biokemiske test og beskriver ikke altid stammerne. Ved diagnosticering af en infektion, skal teknikeren identificere en særlig art og endda også en specifik stamme, for at kunne fastlægge den rette behandling. Til dette formål, er en specifik serie af biokemiske tests blevet udviklet til hurtig identifikation på for eksempel hospitalslaboratorier. Hurtige tests er blevet udviklet til gær, såvel som til andre svampe og til bakterier.
Hurtige metoder til identifikation af medicinsk vigtige bakterier, som for eksempel enteriske, er fremstillet som kits. Sådanne værktøjer, er designet til at udføre flere forskellige biokemiske tests samtidigt og kan identificere bakterierne på 4 til 24 timer. Dette kaldes numerisk identifikation, fordi resultaterne af hver test er tildelt et nummer. I den simpleste form, ville en positiv test tildeles en værdi på 1 og en negativ test en værdi på 0. I de fleste kommercielle testkit, tildeles testresultaterne en værdi fra 1 til 4, som er baseret på den relative pålidelighed og betydning af hver test og den resulterende total, sammenlignes med en database over kendte organismer.
I eksemplet vist i figur 8.2.3.2, er en ukendt enterisk bakterie inokuleret i te rør, der er beregnet til at udføre 15 biokemiske tests. Efter inkubation, registreret resultaterne fra hver biokemiske test. Bemærk at hver test er tildelt en værdi; et kodenummer er afledt af summen fra alle tests. Fermentation af glucose er vigtig og en positiv reaktion gives værdien 4, sammenlignet med produktionen af indol, som har en værdi på 1.
En computer-fortolkning af de samtidige testresultater er afgørende og bliver leveret af producenten. En begrænsning ved biokemiske tests er, at mutationer og plasmiderhvervelse kan resultere i stammer med forskellige karakteristika. Med mindre der anvendes et stort antal tests, kunne en organisme derved blive ukorrekt identificeret.
8.2.4 Serologi
Serologi er den videnskab, der studerer serum- og immunreaktioner, der er tydelige i serummet. Mikroorganismer er et antigen; det vil sige mikroorganismer der, når de træder ind i et dyrs krop, stimulerer dyrets immunforsvar til at danne antistoffer. Antistoffer er proteiner, der cirkulerer rundt i kroppen med blodet og kombineres på en specifik måde til de mirkoorganismer der forårsagede deres produktion. For eksempel kan immunsystemet hos en kanin der injiceres med døde tyfusbakterier (antigener), reagere ved at producere antistoffer mod tyfusbakterierne. Opløsninger af sådanne antistoffer, anvendes i identifikationen af mange medicinsk vigtige bakterier og er kommercielt tilgængelige; en sådan opløsning, kaldes et antiserum (flertal: antisera). Hvis en ukendt bakterie er blevet isoleret fra en patient, kan den testes mod kendte antisera og ofte identificeres hurtigt.
I en procedure, der kaldes objektglasagglutinationsprøve, bliver prøver af ukendte bakterier placeret i en dråbe saltvand på flere forskellige objektglas. Derefter tilsættes der forskellige kendte antisera til hver prøve. Bakterierne agglutinerer (klumper), når de blandes med antistoffer der blev produceret som en reaktion på den pågældende art eller stamme af bakterien; en positiv test indikeres ved tilstedeværelsen af agglutination. En positiv og negativ objektglasagglutinationsprøve er vist i figur 8.2.4.1.
Serologisk testning, kan ikke blot skelne mellem mikrobielle arter, men også blandt stammer inden for samme art. Stammer med forskellige antigener, kaldes serotyper, serovarer eller biovarer. Som nævnt i del 1.3.6, var Rebecca Lancefield i stand til at klassificere streptokok serotyper, ved at studere serologiske reaktioner. Hun fandt, at de forskellige antigener i cellevæggene hos forskellige serotyper af streptokokker, stimulerede dannelsen af forskellige antistoffer. Fordi nærtbeslægtede bakterier også producerer nogle af de samme antigener, kan serologisk undersøgelse anvendes til at screene bakterielle isolater for mulige ligheder. Hvis et antiserum reagerer med proteiner fra forskellige bakteriearter eller stammer, kan disse bakterier testes yderligere for slægtsskab.
Serologiske tests blev anvendt til at bestemme, om det øgede antal nekrotiserende fasciitis i USA og England siden 1987, skyldtes en fælles kilde til infektionerne. Ingen fælles kilde blev identificeres, men der har været en stigning i to serotyper af Streptococcus pyogenes, der er blevet døbt ”den kødædende bakterie”.
En test, der kaldes ”Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay” (ELISA) er almindeligt anvendt, fordi den hurtigt kan aflæses af en computerscanner (figur 8.2.4.2). I en direkte ELISA, er kendte antistoffer placeret i brønde i en mikroplade og en ukendt bakterie tilsættes til hver brønd. En reaktion mellem de kendte antistoffer og bakterierne resulterer i identifikation af bakterierne. En ELISA test anvendes i AIDS tests til påvisning af tilstedeværelsen af antistoffer mod Human Immunodefiency Virus (HIV), virussen der forårsager AIDS.
Andre serologiske tests, som for eksempel Western blotting, anvendes også til at identificere antistoffer i en patients serum (figur 8.2.4.2). HIV infektion bliver bekræftet med Western blotting og borreliose, der forårsages af Borrelia burgdorferi, diagnosticeres ofte med Western blotting.
Kilderne til fødevarebårne infektioner, kan spores ved fagtypning. En version af denne procedure, begynder med en plade helt dækket med bakterier, der vokser på agar. En dråbe af hver forskellige fagtype, der skal anvendes i testen, placeres derefter på bakterierne. Uanset hvor fagerne inficerer og lyserer bakteriecellerne, vil lysninger i bakterievæksten (kaldet plakker) kunne ses (se figur 8.2.5.1). En sådan test kan for eksempel vise, at bakterier isoleret fra et kirurgisk sår, har det samme mønster af fagfølsomhed, som dem isoleret fra kirurgen eller de kirurgiske sygeplejersker. Dette resultat kan fastslå, at kirurgen eller sygeplejerskerne er kilden til infektionen.
8.2.6 Fedtsyreprofiler
Bakterier syntetiserer en bred vifte af fedtsyrer og generelt er disse fedtsyrer konstante for en bestemt art. Kommercielle systemer er designet til at adskille cellulære fedtsyrer for at sammenligne dem med fedtsyreesterprofiler fra kendte organismer. Fedtsyreprofiler kaldes også FAME (Fatty Acid Methyl Ester), er meget udbredte i kliniske og folkesundhedsmæssige laboratorier.
8.2.7 Flowcytometri
Flowcytometri kan anvendes til at identificere bakterier i en prøve, uden forudgående dyrkning af bakterierne. I et flowcytometer, tvinges en bevægende væske indeholdende bakterierne, gennem en lille åbning. Den enkleste metode, detekterer tilstedeværelsen af bakterier, ved at påvise forskellen i elektrisk ledningsevne mellem celler og det omgivende medium. Hvis væsken der passerer gennem åbningen belyses med laser, giver spredningen af lyset oplysninger om cellestørrelse, form, densitet og overflade. Dette analyseres så af en computer. Fluorescens kan anvendes til at detektere naturligt fluorescerende celler, som for eksempel Pseudomonas, eller cellet mærket med fluorescerende farvestoffer.
En foreslået test, der bruger flowcytometri til påvisning af Listeria i mælk, kan spare tid, fordi bakterierne ikke ville skulle dyrkes for identifikation. Antistoffer mod Listeria kunne mærkes med et fluorescerende farvestof og tilsættes mælken der skal testes. Mælken ledes herefter gennem flowcytometeret, der registrerer fluorescensen af de antistof-mærkede celler.
8.2.8 DNA basesammensætning
Taksonomer kan bruge en organismes DNA basesammensætning, til at drage konklusioner om slægtsskab. Denne basesammensætning, udtrykkes normalt som procentdelen af guanin plus cytosin (G + C). Basesammensætningen af en enkelt art, er teoretisk en fast værdi; således kan en sammenligning af G + C indholdet i forskellige arter, afsløre graden af slægtsskab. Hver guanin (G) i DNA har en komplementær cytosin (C). Tilsvarende har hver adenin (A) i DNA en komplementær thymin (T). Derfor kan den procentdel af DNA baser der er GC par også fortælle os den procentdel der er AT par (GC + AT = 100%). To organismer, der er nært beslægtede og har mange identiske eller lignende gener, vil have tilsvarende mængder af de forskellige baser i deres DNA. Men hvis der er en forskel på over 10% i deres procentdel af GC par (for eksempel hvis en bakterie indeholder 40% GC og en anden bakterie har 60% GC), så er disse to organismer sandsynligvis ikke relaterede. Selvfølgelig, er to organismer der har den samme procentdel GC, ikke nødvendigvis tæt knyttet; der er behov for andre understøttende data for at drage konklusioner om deres fylogenetiske forhold.
I det seneste årti, har sammenligning af DNA sekvenser ført til store fremskridt i at omklassificere kendte arter og identificerer nye arter. Genetiske sekvenser af hundredevis af organismer, er samlet i databaser, som kan anvendes online via BioProject.
8.2.9 DNA fingeraftryk
Bestemmelse af hele sekvensen af baser i en organismes DNA er upraktisk for et laboratorie der arbejder med identifikation, fordi det er en tidskrævende proces. Imidlertid gør anvendelsen af restriktionsenzymer det muligt for forskerne af sammenligne basesekvenser fr forskellige organismer. Restriktionsenzymer skærer et molekyle af DNA op, hvor end en bestemt sekvens af baser forekommer og producerer restriktionsfragmenter. For eksempel, skærer enzymet EcoRI DNA ved pilene i sekvensen herunder:
Ved denne teknik, kan DNA’et fra to mikroorganismer, behandles med det samme restriktionsenzym, og restriktionsfragmenterne (RFLP’er) produceret, kan adskilles ved elektroforese, der fremstiller et DNA fingeraftryk. Sammenligning af antallet og størrelsen af restriktionsfragmenterne, der er fremkommet fra to forskellige organismer, indeholder oplysninger om deres genetiske ligheder og forskelle; jo mere ens deres mønstre, eller DNA fingeraftryk, er, desto nærmere beslægtede må de to organismer forventes at være (se figur 8.2.9.1).
DNA fingeraftryk, bruges til at bestemme kilden til hospitalserhvervede infektioner. På et hospital, udviklede patienter der gennemgik en koronar-bypass operation, infektioner forårsaget af Gordonia bronchialis. DNA fingeraftryk fra patienternes bakterier og bakterier fra en sygeplejerske, var identiske. Hospitalet var således i stand til at bryde infektionskæden af transmissionen, ved at tilskynde sygeplejersken til at anvende antiseptiske teknikker mere grundigt.
Dette har ført til interesse i at finde et par gener, som er tilstede i alle arter og som giver en stor variation mellem arterne. Primere til disse gener vil blive anvendt med PCR for frembringelse af en slags DNA stregkode for hver art. Det blev først foreslået i 2003 for eukaryote arter, men de nødvendige seks til ni gener for bakteriel identifikation, er endnu ikke blevet fundet.
8.2.10 Nukleinsyreamplifikationstests
Når en mikroorganisme ikke kan dyrkes ved traditionelle fremgangsmåder, kan en agens for en smitsom sygdom ikke genkendes. Imidlertid kan nukleinsyreamplifikationstests (Nucleic Acid Amplification Tests – NAATs) bruges til at øge mængden af mikrobielt DNA op til niveauer, som kan afprøves ved gelelektroforese. NAATs anvender PCR, revers-transskriptions PCR og realtids PCR. Hvis der anvendes en primer til en specifik mikroorganisme, vil tilstedeværelsen af amplificeret DNA indikere at mikroorganismen er til stede.
I 1992, brugte forskere PCR til at bestemme agensen for Whipples sygdom, der tidligere var en ukendt bakterie, der nu hedder Tropheryma whipplei. Whipples sygdom, blev første gang beskrevet i 1907 af George Whipple som en gastrointestinal og nervesystemslidelse forårsaget af en ukendt bakterie. Ingen har kunnet dyrke bakterien til identifikation; således giver PCR den eneste pålidelige metode til diagnosticering og behandling af sygdommen.
I de senere år, har PCR muliggjort flere opdagelser. For eksempel i 1992, hvor Raul Cano brugte PCR til at amplificere DNA fra Bacillus bakterier i rav, der var 25 til 40 millioner gamle. Disse primere blev fremstillet ud fra rRNA sekvenser fra levende B. circulans til at forstærke rRNA fra ravet. Disse primere, vil forårsage amplifikation af DNA fra andre Bacillus arter, men vil ikke amplificere DNA fra andre bakterier, der vil være til stede, som for eksempel Escherichia eller Pseudomonas. DNA’et blev sekventeret efter amplifikationen. Disse oplysninger blev anvendt til at bestemme forholdet mellem de gamle bakterier og moderne bakterier.
I 1993, fik mikrobiologer ved hjælp af PCR, identificeret en Hantavirus, som årsag til et udbrud af hæmoragisk blødningsfeber i det sydvestlige Amerika. Identifikationen blev lavet på rekordtid – mindre end to uger. PCR blev anvendt i 1994 til at identificere agensen af en ny flåtbåren sygdom (human granolocytisk ehrlichiosis) der forårsages af Ehrlichia chaffeensis. PCR bruges også til at identificere kilden til rabiesvirus.
I 2013, brugte sundhedspersonale realtids PCR til at identificere en ny stamme af H7N9 influenzavirusset.
8.2.11 Nukleinsyrehybridisering
Hvis et dobbeltstrenget molekyle af DNA udsættes for varme, vil de to komplementære strenge adskilles, da hydrogenbindingerne mellem baserne brydes. Hvis enkeltstrengene herefter afkøles langsomt, vil de gendanne sig til et dobbeltstrenget molekyle, identisk med den oprindelige dobbeltstreng (denne gendannelse opstår, fordi de enkelte strenge har komplementære sekvenser). Når denne teknik anvendes på adskilte DNA strenge fra to forskellige organismer, er det muligt at bestemme omfanget af ligheden mellem basesekvenserne for de to organismer. Denne metode er kendt som nukleinsyrehybridisering. Denne procedure forudsætter, at hvis to arter er ens eller relaterede, vil en stor del af deres nukleinsyresekvenser også være ens. Proceduren måler DNA strengene fra en organismes evne til at hybridisere (bindes gennem komplementær baseparring) med DNA strengene fra en anden organisme (se figur 8.2.11.1). Jo større graden af hybridisering, jo større grad af slægtsskab.
Lignende hybridiseringsreaktioner kan forekomme mellem enhver enkeltstrenget nukleinsyrekæde: DNA-DNA, RNA-RNA og DNA-RNA. En RNA-transskription vil hybridisere med det adskilte skabelon DNA og danne et DNA-RNA hybridmolekyle. Nukleinsyrehybridiseringsreaktioner er grundlaget for adskillige teknikker (der beskrives herefter), der bruges til at påvise tilstedeværelsen af mikroorganismer og til at identificere ukendte organismer.
Southern blotting
Nukleinsyrehybridisering kan anvendes til at identificere ukendte mikroorganismer ved Southern blotting. Derudover, er hurtigmetoder til identifikation ved brug af DNA sonder, under udvikling. En metode, involverer ekstraktion DNA fra Salmonella, der nedbrydes til fragmenter med et restriktionsenzym og herefter udvælge et specifikt fragment som sonden for Salmonella (se figur 8.2.11.2). Dette fragment skal kunne hybridisere med DNA fra alle Salmonella stammer, men ikke med DNA far nært beslægtede enteriske bakterier.
8.2.12 DNA chip
En spændende ny teknik er DNA chip eller mikroarray, der hurtigt kan detektere et patogen i en vært eller i miljøet, ved at identificere et gen, der er unikt for dette patogen (se figur 8.2.12.1). DNA chippen er sammensat af DNA sonder. En prøve indeholdende DNA fra en ukendt organisme, er mærket med fluorescerende farvestof og tilsættes chippen. Hybridisering mellem sonde DNA og DNA i prøven kan herefter detekteres ved fluorescens.
Ribotypning og ribosomal RNA sekventering
Ribotypning anvendes ved bestemmelse af fylogenetiske relationer mellem organismer. Der er flere fordele ved at bruge rRNA. For det første indeholder alle celler ribosomer. For det andet har RNA gener undergået få ændringer gennem tiden, så alle medlemmer af et domæne, række – og i nogle tilfælde en slægt – have de samme ”signatursekvenser” i deres rRNA. rRNA’et der oftest anvendes, er en bestanddel af den mindre del af ribosomer. En tredje fordel ved rRNA sekventering er, at cellerne ikke behøver at blive dyrket i laboratoriet.
DNA kan amplificeres ved PCR under anvendelse af en rRNA primer for specifikke signatursekvenser. De amplificerede fragmenter, bliver efterfølgende skåret af et eller flere restriktionsenzymer, og adskilt ved elektroforese. De resulterende båndmønstre kan derefter sammenlignes. rRNA gener i de amplificerede fragmenter, kan sekvensteres til bestemmelse af evolutionære relationer mellem organismer. Denne teknik er nyttig ved klassificering af en nyopdaget organisme til et domæne eller række, eller for at fastlægge generelle typer af organismer i et miljø. Mere specifikke sonder er dog nødvendige for at identificere de enkelte arter.
Fluorescerende In Situ Hybridisering (FISH)
Fluorescerende farvestof-mærkede RNA eller DNA sonder anvendes til at farve in situ. Denne teknik kaldes fluorescerende in situ hybridisering, eller FISH. Cellerne behandles så sonden kommer ind i cellen og reagerer med mål DNA’et i cellen (in situ). FISH anvendes til at bestemme identitet, forekomst og relativ aktivitet af mikroorganismer i et miljø og kan anvendes til at detektere bakterier, der endnu ikke er blevet dyrket. Ved hjælp af FISH, opdagede forskere en lille bakterie kaldet Pelagibacter i havet og kunne fastslå at den er relateret til Rickettsia. Som sonder udvikles, kan FISH anvendes til at detektere bakterier i drikkevand eller bakterier i en patient, uden de normale 24 timers eller længere ventetid der kræves for at dyrke bakterierne (se figur 8.2.12.2).
8.2.13 Sætte klassificeringsmetoderne sammen
Morfologiske karakteristika, differentialfarvning og biokemiske tests, var de eneste identifikationsværktøjer der var til rådighed for blot få år siden. Teknologiske fremskridt gør det i dag muligt at bruge nukleinsyreanalyseteknikker, engang forbeholdt til klassifikation, til rutinemæssig identifikation. Oplysningerne, der tilvejebringes om mikroorganismerne, anvendes til at identificere og klassificere organismerne. To fremgangsmåder til anvendelse af disse oplysninger vil blive beskrevet her.
Dikotome nøgler
Dikotome nøgler er almindeligt brugt til identifikation. I en dikotomisk nøgle, er identifikation baseret på hinanden følgende spørgsmål og hvert spørgsmål har kun to mulige svar (diktome betyder skåret i to). Efter at have besvaret et spørgsmål, bliver undersøgeren dirigeret videre til et andet spørgsmål, indtil en organisme er identificeret. Selv om disse nøgler ofte har meget lidt at gøre med fylogenetiske relationer, er de uvurderlige for identifikation. For eksempel kunne en dikotomisk nøgle for bakterier begynde med en egenskab der er let at bestemme, som for eksempel celleform og gå videre til evnen til at fermentere en sukker. Et eksempel på en dikotomisk nøgle er vist i figur 8.2.3.1.
Kladogrammer
Kladogrammer er kort, der viser evolutionære relationer mellem organismer (clado betyder gren). Figur 8.1.1.1 og figur 8.1.5.1 viser eksempler på kladogrammer. Hvert forgreningspunkt på et kladogram, er defineret som et træk der deles af forskellige arter på denne gren. Historisk set blev kladogrammer for hvirveldyr lavet ved hjælp af fossile beviser; imidlertid kan rRNA sekvenser nu bruges til at bekræfte fossilt baserede antagelser. Som tidligere nævnt, efterlader de fleste mikroorganismer ikke fossiler; derfor er rRNA sekventering den primære kilde til et kladogram for mikroorganismer. Den lille rRNA underenhed der anvendes, har 1.500 baser og computerprogrammer laver beregningerne. Trinene for et kladogram er vist i figur 8.2.13.1.
